大腸埃希菌臨床菌株生物被膜形成的分析-醫(yī)學(xué)臨床論文

Quantificative analysis for Biofilm-Formation of Escherichia coli Isolates

ABSTRACT: Objective Escherichia coli clinical isolateswere analyzed quantitatively for their biofilm-formation. Methods A method of microtiterplate culture-crystal violet stain was established for the quantificative analysis of biofilm-formation for the isolates. And 49 Escherichia coli isolates were testeded by the method for their biofilm-formation. Results Among 49 Escherichia coli isolates examined, 18 formed biofilm of middle quantity, 24 more quantity biofilm, 7 small quantity. Conclusion Most of Escherichia coli clinical isolates formed biofilm of middle and more-quantity.

KEY WORDS: Escherichia coli；bacterial biofilm；quantificative analysis

摘要：許多病原性細(xì)菌在感染機(jī)體內(nèi)可以生物被膜狀態(tài)存在，生物被膜的形成是某些細(xì)菌性疾病難以治愈或反復(fù)發(fā)作的主要原因之一[4,5]。大腸埃希菌（Escherichia coli）是醫(yī)院常見(jiàn)條件致病菌之一，是典型的生物被膜菌[1-5]。本研究通過(guò)建立大腸埃希菌生物被膜的檢測(cè)方法，分析大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的形成。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌；細(xì)菌生物被膜；定量分析

中圖分類(lèi)號(hào)：R387.99  文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

材料和方法

一、試驗(yàn)菌株 

49株大腸埃希菌，分離自2008年1月至2月間江西省九江市第一人民醫(yī)院患者的各類(lèi)標(biāo)本（痰液、尿液、創(chuàng)口分泌物、血液），經(jīng)美國(guó)BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)，生物被膜陽(yáng)性銅綠假單胞菌PAO1。

二、大腸埃希菌生物被膜檢測(cè)方法的建立

    參考文獻(xiàn)方法[6]建立大腸埃希菌生物被膜檢測(cè)方法。對(duì)在49株大腸埃希菌臨床菌株中隨機(jī)選取的6株菌、生物被膜陽(yáng)性銅綠假單胞菌PAO1進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)。將上述7株菌在Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，用細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)比濁管調(diào)節(jié)菌液濃度為1×109CFU/mL；用96孔平底組織培養(yǎng)板培養(yǎng)生物被膜，每孔加入10μL菌液和200μL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)液（1:50稀釋?zhuān)?，空白?duì)照孔只加培養(yǎng)液，每株菌作6個(gè)復(fù)孔，37℃靜止培養(yǎng)。選取72h生物被膜培養(yǎng)物進(jìn)行定量分析。每個(gè)菌取3個(gè)復(fù)孔，加入150μL 0.25g/L結(jié)晶紫染液，室溫下染色15min；用生理鹽水沖洗后晾干；每孔加入95％乙醇150μL，室溫脫色10min；用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)每孔脫色液在570nm光波的吸光度(A570nm)。每個(gè)菌的A570nm等于其3個(gè)復(fù)孔的A570nm平均值減去3個(gè)空白對(duì)照孔A570nm的平均值。同時(shí)，對(duì)每個(gè)菌的另3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，即每孔加入150μL 0.25g/L結(jié)晶紫染液，室溫下染色15min；再用自制的細(xì)胞刮刀刮取培養(yǎng)孔底部及側(cè)壁的生物被膜，收集被膜菌液，在漩渦振蕩器上將菌體充分打散；最后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)染色菌體的數(shù)量；每個(gè)培養(yǎng)孔生物被膜中細(xì)菌的數(shù)量取3個(gè)復(fù)孔的平均值。

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各大腸埃希菌生物被膜結(jié)晶紫染色的乙醇脫色液A570nm值與其相應(yīng)生物被膜中細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，以判斷能否以乙醇脫色液A570nm值輔助衡量比較生物被膜中細(xì)菌的數(shù)量。生物被膜中細(xì)菌的數(shù)量越多，則表明生物被膜形成的量越多。

三、大腸埃希菌臨床菌株生物被膜形成的半定量分析

  按上述方法，檢測(cè)48株大腸埃希菌臨床分離株生物被膜的形成，即生物被膜培養(yǎng)物乙醇脫色液的A570nm。生物被膜陽(yáng)性菌銅綠假單胞菌PAO1可形成中等厚度、或量的生物被膜，本試驗(yàn)中該菌的A570nm為0.456，同時(shí)參照文獻(xiàn)方法[6，7]，將所測(cè)各菌株生物被膜形成的量分為三個(gè)等級(jí)：A570nm ≤ 0.3 者為生物被膜形成的量少，以“＋”表示；0.3 ＜A570nm  ≤ 1.0者為生物被膜形成的量中等，以“＋＋”表示；1.0 ＜A570nm者為生物被膜形成的較大，以“＋＋＋”表示。按上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各菌株生物被膜形成的量進(jìn)行比較分析。

結(jié)  果

一、大腸埃希菌生物被膜形成的定量分析方法的建立 

隨機(jī)選取的6株大腸埃希菌臨床分離株和生物被膜陽(yáng)性對(duì)照菌進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)，分別得到生物被膜結(jié)晶紫染液之乙醇脫色液A570nm，以及生物被膜中細(xì)菌的數(shù)量。經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，生物被膜中細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)與其A570nm成正相關(guān)（r＝0.945）(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明以大腸埃希菌生物被膜結(jié)晶紫染液的乙醇脫色液A570nm 可衡量比較生物被膜中細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量。

圖1 大腸埃希菌臨床分離株生物被膜中細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)與A570nm的相關(guān)性分析.

（A570nm：細(xì)菌生物被膜乙醇脫色液在570nm光波的吸光度；

Log10CFU：細(xì)菌生物被膜中細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)）

二、大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的分析

在所檢測(cè)的49株大腸埃希菌臨床菌株中，其中24株菌（49.0％）形成生物被膜的量較大（＋＋），18株（36.7％）形成生物被膜的量為中等（＋＋＋），7株菌(14.3％)形成生物被膜的量少（＋）。                                                                                  

討論

細(xì)菌在形成生物被膜的過(guò)程中，伴隨著某些性狀的變化，這些變化有些與菌體抗性的提高有關(guān)，如大量胞外多糖的產(chǎn)生，減低了抗生素向被膜內(nèi)部的滲透；細(xì)菌在生物被膜狀態(tài)下，很多物質(zhì)（特別是大分子物質(zhì)）難以進(jìn)行正常的物質(zhì)交換作用，在被膜內(nèi)部的細(xì)菌往往是處于一種低代謝、低能耗和低活性的狀態(tài)，導(dǎo)致菌體對(duì)抗生素的敏感性減低；被膜內(nèi)部的菌株發(fā)生突變形成耐藥株等，這些變化都有利于提高菌體對(duì)抗生素的耐受性，研究報(bào)道細(xì)菌在生物被膜狀態(tài)的耐藥性比游離的單個(gè)菌體顯著提高[1-4]。此外生物被膜還可向周?chē)h(huán)境緩慢釋放浮游菌，成為潛在的感染源。故細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌感染難以治愈或感染反復(fù)發(fā)作的重要原因。細(xì)菌形成生物被膜的厚度和體積大小不一，被膜的厚度和體積越大，往往抗性也越強(qiáng)。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)測(cè)得的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentraton，MIC）是針對(duì)單個(gè)存在的細(xì)菌。據(jù)報(bào)道用傳統(tǒng)的藥物敏感試驗(yàn)測(cè)得的某菌株對(duì)抗生素的MIC和生物被膜敏感實(shí)驗(yàn)所測(cè)得細(xì)菌生物被膜的最小抑菌濃度（Biofilm inhibitory concentration，BIC)是不相同的，兩類(lèi)藥敏試驗(yàn)所選出的敏感藥物的種類(lèi)也存在很大差別[8]。因此如不考慮細(xì)菌在感染機(jī)體形成生物被膜的特性，只依據(jù)傳統(tǒng)方法測(cè)得的MIC指導(dǎo)臨床抗生素的使用，對(duì)生物被膜菌感染的治療很難達(dá)到滿意的效果，因此臨床在使用抗生素治療生物被膜菌感染時(shí)應(yīng)考慮細(xì)菌形成生物被膜的性。

本文采用平板培養(yǎng)法建立大腸埃希菌生物被膜的體外模型，并借鑒文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6，7]建立了大腸埃希菌平板培養(yǎng)－結(jié)晶紫染色的生物被膜檢測(cè)方法，該法可分析大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的形成，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)49株大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的形成進(jìn)行分析中，結(jié)果表明絕大多數(shù)大腸埃希菌臨床菌株能形成較厚的生物被膜。本研究結(jié)果提示在臨床治療大腸埃希菌相關(guān)感染時(shí)，若遇到依據(jù)傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行抗生素治療效果不佳的情況，或大腸埃希菌感染久治不愈時(shí)，應(yīng)考慮對(duì)致病菌株進(jìn)行生物被膜的形成進(jìn)行檢測(cè)，或做細(xì)菌生物被膜藥物敏感試驗(yàn)，選擇細(xì)菌生物被膜敏感的抗生素，以提高大腸埃希菌感染的臨床治療效果。

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