脂肪酶催化制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的工藝研究
肥胖已成為世界范圍內(nèi)的首要健康問題,是導(dǎo)致幾種慢性疾病的危險(xiǎn)因素。能量攝入和能量消耗之間不平衡導(dǎo)致人體內(nèi)的脂肪不斷堆積,越來越多的人通過以低熱量脂肪替代傳統(tǒng)膳食脂肪來降低對(duì)高熱量的攝入。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是一類由傳統(tǒng)油脂改性而成的低熱量油脂,具有特殊的脂肪酸組成和位置分布,能夠在提供人體所必須的營(yíng)養(yǎng)的同時(shí),很好地降低熱量。
長(zhǎng)短鏈甘油三酯(Salatrim)以短鏈脂肪酸為酰基供體,易于吸收,不易堆積,是一種能代替普通油脂為人體供能的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于長(zhǎng)短鏈甘油三酯的合成研究已不在少數(shù)。張晶等以三乙酸甘油酯和三油酸甘油酯在Lipozyme TL IM催化作用下,酯交換合成SLCTs,經(jīng)優(yōu)化條件實(shí)驗(yàn)后,長(zhǎng)短鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)酯的產(chǎn)率達(dá)到76%。Cao等則利用茶籽油脂肪酸甲酯與三乙酸甘油酯進(jìn)行酯交換反應(yīng),制備的 SLCTs 具有降低餐后血脂的功能。
丁酸(Butyrate acid,BA),俗稱酪酸,是構(gòu)成脂肪的一種脂肪酸,含有4個(gè)碳原子的短鏈飽和脂肪酸。丁酸對(duì)結(jié)腸壁細(xì)胞有多重保護(hù)作用,并可以延伸到結(jié)腸外,減少脂肪堆積、控制脂肪肝、降低血糖,對(duì)人體和大腦都有的健康作用。隨著年齡的增長(zhǎng),人體內(nèi)的腸道微生物大量減少,微生物發(fā)酵生成的丁酸不能滿足腸道細(xì)胞的需要,腸道老化現(xiàn)象嚴(yán)重,這時(shí)補(bǔ)充外源性丁酸將有助于人體機(jī)能提升。多數(shù)研究以三丁酸甘油酯為原料,通過與天然油脂或脂肪酸甲酯酯交換制得長(zhǎng)短鏈甘油三酯,或者直接以丁酸酸解催化油脂制得產(chǎn)物。如Han等用Lipozyme RM IM催化三丁酸甘油酯和硬脂酸甲酯的酯交換反應(yīng)合成一種低熱量的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。目標(biāo)產(chǎn)品在最佳條件下經(jīng)短程分子蒸餾后所顯示的固體脂肪含量值類似于可可脂替代品、可可脂當(dāng)量和可可脂,表明其應(yīng)用于與其他脂肪包合作為可可脂替代品。Tsuzuki等研究了不同脂肪酶在有機(jī)溶劑體系下催化短鏈脂肪酸,如乙酸、丙酸和丁酸,與三油酸甘油酯進(jìn)行酸解反應(yīng),發(fā)現(xiàn)丁酸更易插入三油酸甘油三酯中替代油酸。當(dāng)前關(guān)于以丁酸乙酯為原料,通過酯交換制得長(zhǎng)短鏈甘油三酯的工藝未見有報(bào)道。
本研究旨在在無溶劑介質(zhì)中,通過脂肪酶催化大豆油和丁酸乙酯酯交換反應(yīng),以丁酸插入率為指標(biāo),探究合成長(zhǎng)短鏈甘油三酯的最佳反應(yīng)條件。本文在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上豐富了國(guó)內(nèi)對(duì)大豆油改性制備低熱量結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的全面研究,進(jìn)而促進(jìn)了社會(huì)發(fā)展。
一、材料與方法
1.實(shí)驗(yàn)材料
大豆油(浙江益海嘉里食品工業(yè)有限公司);丁酸乙酯(純度>98%,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);固體脂肪酶Novozyme 435(諾維信生物技術(shù)有限公司);丁酸甲酯(上海Merck公司);正己烷及其他有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純。
SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司);氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);BS224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);離心機(jī)(常州國(guó)華電器有限公司)。
2.實(shí)驗(yàn)方法
(1)長(zhǎng)短鏈脂肪酸甘油三酯的制備與分離。制備:大豆油與丁酸乙酯的酯交換反應(yīng)在無溶劑體系中進(jìn)行,稱取15g的大豆油與一定量的丁酸乙酯置與150mL的錐形瓶?jī)?nèi),混合均勻,并加入一定量的固定化脂肪酶Novozyme 435,蓋緊塞子,將其放在恒溫水浴振蕩器中,保持100r/min的振蕩速率,在特定溫度下反應(yīng)4h后終止,過濾除去固體脂肪酶。
薄層層析法分離:選用100mm×200mm規(guī)格的硅膠板,對(duì)丁酸乙酯、大豆油和酶催化大豆油與丁酸乙酯合成的長(zhǎng)短鏈甘油三酯產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析,參照標(biāo)準(zhǔn)譜圖將對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)短鏈甘油三酯條帶刮下,用正己烷萃取2次,加入適量的無水硫酸鈉,然后旋蒸除去正己烷。
(2)產(chǎn)物組成分析。采用氣相色譜檢測(cè)方法:稱取0.1g樣品,溶于10mL正己烷中,混合均勻后取1mL置于色譜瓶中進(jìn)行氣相分析。
氣相色譜條件:色譜柱DB-1HT 毛細(xì)血管(29m×250μm×0.2μm);載氣N2(純度99.999%);進(jìn)樣量1,進(jìn)樣口溫度260℃,分流比20∶1;氫火焰離子化檢測(cè)器,檢測(cè)口溫度380℃;氫氣流量60mL/min,空氣流量400L/min,尾吹氣流量50mL/min。程序升溫條件:溫度80℃,保持2min;然后以10℃/min的升溫速率持續(xù)加熱至200℃,保持1min;再以30℃/min的升溫速率加熱至350℃,保持6min。
(3)脂肪酸組成分析。甲酯化方法:稱取100mg分離后的產(chǎn)物,加入2mL 0.2mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液快速混勻,再移取3mL的正己烷震蕩30s,使之充分混合后,放入離心機(jī)離心2min,獲得分層溶液,將上層透明澄清溶液用無水硫酸鈉干燥,然后吸取上清液用于氣相分析。
二、結(jié)果與討論
1.產(chǎn)物組成分析。
產(chǎn)物甲酯化后的氣相色譜圖,對(duì)照各標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)產(chǎn)物譜圖進(jìn)行定性分析,丁酸甲酯保留時(shí)間2.119min,棕櫚酸甲酯保留時(shí)間15.176min,硬脂酸甲酯保留時(shí)間16.642min,油酸甲酯保留時(shí)間16.905min,亞油酸甲酯保留時(shí)間17.383min,亞麻酸甲酯保留時(shí)間17.887min。根據(jù)圖中數(shù)據(jù)可以看出,在本實(shí)驗(yàn)選定的反應(yīng)條件下,圖中未出現(xiàn)太多雜峰,且各脂肪酸甲酯的分離情況較好。
2.單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。(1)反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物中長(zhǎng)短鏈甘油三酯的影響。在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比3∶1、反應(yīng)溫度50 ℃、加酶量為總底物的9%時(shí),每次間隔2h進(jìn)行一次產(chǎn)物取樣,以探究制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的最佳反應(yīng)時(shí)間。
在不同反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行長(zhǎng)短鏈甘油三酯的制備,丁酸的插入率發(fā)生了改變。在開始反應(yīng)的10h內(nèi),隨著時(shí)間的推移,反應(yīng)速度加快,丁酸的插入率持續(xù)提升;在反應(yīng)了10h時(shí),丁酸的插入率已經(jīng)達(dá)到了12.16%;而在反應(yīng)了10h之后,丁酸的插入率反而下降了。這是因?yàn)轷ソ粨Q反應(yīng)是一個(gè)對(duì)峙反應(yīng),也可以用化學(xué)動(dòng)力學(xué)平衡理論對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行解釋。在反應(yīng)早期,正向反應(yīng)的速率快于反向反應(yīng)的速率,因此丁酸插入率會(huì)不斷增加。但是,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,反向反應(yīng)的速率逐漸增加,正向反應(yīng)的速率逐漸降低,最終達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,這時(shí)反應(yīng)的產(chǎn)物和反應(yīng)物濃度不再發(fā)生變化,所以插入率也不再增加。而隨著時(shí)間的推移,由于反向反應(yīng)速率增加,丁酸插入率反而會(huì)下降。綜合考慮,反應(yīng)進(jìn)行10h為最佳。在本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)階段將會(huì)把反應(yīng)10h時(shí)的數(shù)據(jù)作為主要數(shù)據(jù)。
(2)加酶量對(duì)長(zhǎng)短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時(shí)間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1、反應(yīng)溫度為50℃的反應(yīng)條件下,探究不同反應(yīng)溫度對(duì)制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的影響。
在加酶量為3%~9%時(shí),丁酸插入率隨著加酶量的增加而增加,但在加酶量超過9%后,丁酸插入率反而隨著加酶量的提升而降低。在反應(yīng)初期,較高的加酶量會(huì)促進(jìn)酶活性位點(diǎn),提高反應(yīng)速率,導(dǎo)致?;w的摻入量增加。同時(shí)這一時(shí)期,底物分子與酶分子的結(jié)合比較容易,酶底物復(fù)合物的形成速率較快,這就使得丁酸插入率隨著加酶量的增加而提升。但當(dāng)加酶量超過一定閾值時(shí),丁酸插入率反而會(huì)隨著加酶量的增加而降低,這是因?yàn)?/span>隨著反應(yīng)的進(jìn)行,脂肪酶產(chǎn)生聚集,致使底物難以擴(kuò)散,從而導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。為了降低生產(chǎn)成本并提高反應(yīng)效率,加酶量控制在9%為最佳。
(3)反應(yīng)溫度對(duì)長(zhǎng)短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時(shí)間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1、加酶量為總底物9%時(shí),探究不同反應(yīng)溫度對(duì)制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的影響。
在反應(yīng)溫度為40~60℃時(shí),丁酸插入率顯著提升,根據(jù)Arrhenius定律,反應(yīng)溫度的升高通常導(dǎo)致由酶催化的加速效應(yīng)。由于熱力學(xué)平衡的移動(dòng),高溫有利于反應(yīng)正向移動(dòng),同時(shí)較高的溫度降低了溶液的粘度,減少了傳質(zhì)限制,此時(shí)底物分子與酶分子之間的相互作用增強(qiáng),酶與底物的結(jié)合力增加,使得酶底物復(fù)合物的形成速率提高。然而,當(dāng)反應(yīng)溫度超過一定閾值時(shí),酶會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化,酶分子的空間構(gòu)型發(fā)生改變,酶的催化活性會(huì)受到影響;同時(shí),溫度升高也會(huì)加速酶的失活,降低酶的穩(wěn)定性,使酶分子失去原有的催化能力,從而導(dǎo)致丁酸插入率開始降低。
(4)丁酸乙酯與大豆油的摩爾比對(duì)長(zhǎng)短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時(shí)間為10h、反應(yīng)溫度為60℃、加酶量為總底物的9%的反應(yīng)條件下,探究丁酸乙酯與大豆油的不同摩爾比對(duì)制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的影響。
酯交換反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng),反應(yīng)平衡是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,這種平衡僅與起始反應(yīng)物的濃度相關(guān),即丁酸乙酯與大豆油的摩爾比。在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比在1∶1至3∶1的范圍內(nèi)時(shí),隨著底物中丁酸的量不斷上升,丁酸的插入率得到了顯著提升;但是在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比達(dá)到3∶1之后,丁酸插入率轉(zhuǎn)為下降。這是因?yàn)樵诙∷嵋阴ヅc大豆油的摩爾比在1∶1至3∶1的范圍內(nèi)時(shí),丁酸量的增加可以提高丁酸在化學(xué)反應(yīng)中的濃度,從而促進(jìn)丁酸的插入率。但當(dāng)丁酸乙酯與大豆油的摩爾比超過3∶1時(shí),丁酸乙酯的濃度占據(jù)了主導(dǎo)地位,丁酸的濃度相對(duì)降低,從而導(dǎo)致丁酸的插入率下降。綜合考慮,選擇丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1最合適。
三、結(jié)論
以丁酸乙酯和大豆油為原料,固體脂肪酶Novozyme 435為催化劑,探究了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、加酶量和底物比率對(duì)大豆油中丁酸插入率的影響。探究結(jié)果表明:在反應(yīng)時(shí)間為10h、反應(yīng)溫度為50℃、加酶量為9%、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1時(shí),大豆油中丁酸的插入率最高。
文章來源: 《中國(guó)食品》 http://xwlcp.cn/w/qt/29400.html
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