抑制性消減雜交技術(shù)在水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物中的應(yīng)用
自20年前,由于分子生物的迅猛發(fā)展與物種基因組全序列測(cè)定計(jì)劃的逐漸結(jié)束,分子生物學(xué)的研究重心已轉(zhuǎn)向表達(dá)調(diào)控功能與基因功能研究。抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是一種鑒定、分離、篩選組織細(xì)胞中未知基因表達(dá)的新技術(shù),它與抑制PCR與消減雜交相結(jié)合,具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、假陽率低于特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),逐漸被學(xué)界視為應(yīng)用前景最看好的一種分子生物學(xué)研究方法。
一、抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)的原理
抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是在抑制性PCR的基礎(chǔ)上,結(jié)合消減雜交步驟與均等化檢驗(yàn)子DNA單鏈步驟,簡(jiǎn)單快捷地分離差異基因的方法,即富集差異序列,消減同源序列。
這一方法根據(jù)雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué),使分子間原有單鏈DNA的豐度差異消失、DNA相對(duì)含量趨同。抑制性PCR指根據(jù)鏈間退火弱于鏈內(nèi)退火并且鏈內(nèi)退火更為穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)特性,非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列退火時(shí)分離出鍋柄形態(tài)的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),使其不能與引物配對(duì)與作為模板,從而選擇性地使得非目的基因片段難以擴(kuò)增。而在均等基因群的標(biāo)準(zhǔn)化步驟中,消減雜交能起到去除驅(qū)趕基因群和目的基因群之間的共有基因序列的作用,以正常擴(kuò)增基因的不同序列。
二、抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
2.1 優(yōu)點(diǎn):在鑒定、分離、篩選與克隆差異表達(dá)的基因序列片段中,這種方法更適用于差異表達(dá)的新基因的發(fā)現(xiàn);這種方法一般情況下4天左右就能得到差異表達(dá)基因片段的cDNA,其篩選周期比較低;一次抑制性消減雜交反應(yīng)就能夠分離上百個(gè)差異表達(dá)基因,效率非常高;這一技術(shù)成熟、簡(jiǎn)單、易操作掌握。
2.2 缺點(diǎn):這一技術(shù)對(duì)材料的要求高,所采用的材料背景差異不能過大;消減文庫中cDNA不能被酶完全消化,全長(zhǎng)的cDNA無法通過此技術(shù)獲取,因此cDNA非全長(zhǎng);對(duì)模板需求量高,mRNA不符合要求量則很有可能將導(dǎo)致低豐度的cDNA難以被檢測(cè)出來。
三、抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)在水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物中的應(yīng)用
3.1 對(duì)發(fā)育與生殖相關(guān)基因的研究
由于受到不同基因組的調(diào)控,無脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的各個(gè)階段都會(huì)產(chǎn)生分化出不同的器官與組織,該技術(shù)能對(duì)這些基因進(jìn)行鑒定與分離。在研究相關(guān)基因調(diào)控蝦的卵子發(fā)生過程時(shí),有國(guó)外生物學(xué)家使用此技術(shù)建立了日本囊對(duì)蝦卵巢的DNA庫,發(fā)現(xiàn)在核糖體蛋白的精子或卵巢的基因表達(dá)量上有著不小的差異[1]。經(jīng)過分析得出,相對(duì)與肝臟、胰腺、睪丸、眼肌,卵巢中的核糖體蛋白含量要大得多。我國(guó)研究者陳金平使用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)建立了銀鯽心跳起始期與尾芽期的特異性質(zhì)庫,篩選這兩個(gè)階段的特異性基因,與中科院生物研究中心數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,得出心跳起始期絕大部分為已知基因,而232個(gè)尾芽期的雜交克隆中有155個(gè)可能是未知基因。這在很大程度上為分子生物學(xué)的分機(jī)機(jī)理研究做出了貢獻(xiàn)。
3.2 差異表達(dá)基因的篩選
在水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中,其環(huán)境往往受到溶解氧、鹽度與水溫的影響。美國(guó)生物學(xué)家Mercury等對(duì)太平洋牡蠣進(jìn)行試驗(yàn),研究在缺氧的條件下太平洋牡蠣的反應(yīng);日本生物學(xué)家福川對(duì)使用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)對(duì)草蝦基因表達(dá)情況的影響進(jìn)行研究,這種技術(shù)在低滲、低氧和高溫的情況下研究草蝦血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座子和免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況也被廣泛應(yīng)用[2]。
此外,還可通過抑制性消減雜交(SSH)文庫的建立,對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物在污染水環(huán)境狀況下機(jī)能的適應(yīng)程度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析,從而有利于基因差異表達(dá)的發(fā)現(xiàn)及篩選出相應(yīng)基因。瑞典科學(xué)家Manse在2009年研究了后期扇貝幼蟲遭到銅離子的脅迫后的基因差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)了89個(gè)cDNA,其中57個(gè)可能為未知功能,32個(gè)為已知功能[3]。
四、結(jié)論
抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是一種鑒定、分離、篩選組織細(xì)胞中未知基因表達(dá)的新技術(shù),是在抑制性PCR的基礎(chǔ)上,結(jié)合消減雜交步驟與均等化檢驗(yàn)子DNA單鏈步驟,簡(jiǎn)單快捷地分離差異基因的方法。
抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)能對(duì)無脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的各個(gè)階段中產(chǎn)生分化出的不同的器官與組織的基因進(jìn)行分離與鑒定。同時(shí),這種技術(shù)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境在受到溶解氧、鹽度與水溫的脅迫時(shí),也能篩選出水產(chǎn)養(yǎng)殖生物差異表達(dá)的生理功能相關(guān)基因。此外,水產(chǎn)動(dòng)物在水污染環(huán)境下的生理功能適應(yīng)程度也可以對(duì)比抑制性消減雜交(SSH)庫進(jìn)行研究,從而篩選出差異表達(dá)基因。
【參考文獻(xiàn)】
[1]李小慶,景志忠. 抑制性消減雜交技術(shù)的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2009(05)158—162.
[2]單曉楓,孫佳敏,張洪波等. 抑制性消減雜交技術(shù)及其在水生動(dòng)物基因克隆中的應(yīng)用[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010(09):243—249.
[3]楊倩,成軍,劉妍等. 抑制性消減雜交技術(shù)原理及應(yīng)用[J].世界華人消化雜志,2008(11):376—280.
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