牡蠣精氨酸激酶過敏原小鼠過敏模型的建立與分析

在主要的過敏食物中,貝類、魚、花生和堅果更有可能引發(fā)危及生命的全身過敏反應(yīng)[1]。貝類過敏在西方國家中很常見,且逐漸在亞洲部分地區(qū)的兒童和成人中變得普遍[2]。目前已發(fā)現(xiàn)6種貝類過敏原,包括原肌球蛋白、肌漿鈣結(jié)合蛋白、精氨酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、肌漿蛋白輕鏈和肌鈣蛋白[3-7]?？乖状芜M入機體后會誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)抗體,IgE與肥大細胞表面的FcεR I受體結(jié)合,使機體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機體再次暴露于相同抗原時,致敏細胞上的IgE會與其結(jié)合并導(dǎo)致肥大細胞脫顆粒,釋放組胺、類花生酸、蛋白酶和其他趨化和促炎細胞因子等炎癥介質(zhì),這些介質(zhì)會募集白細胞,同時引起平滑肌收縮、血管擴張、黏液高分泌和血管通透性增加等生理病理學(xué)變化,這也是過敏癥狀的發(fā)病機制[8-9]。有證據(jù)表明,牡蠣的攝入、皮膚和黏膜接觸以及霧化牡蠣蛋白的吸入可導(dǎo)致患者出現(xiàn)多種臨床癥狀[10-12],而牡蠣中的精氨酸激酶(arginine kinase,AK)也被驗證為過敏原。

過敏原致敏性可以通過比較序列同源性、IgE結(jié)合、血清檢測、消化率和穩(wěn)定性來評估,目前蝦、蟹等過敏原的研究主要集中在這些方向,但合適的動物模型能更直接地確定蛋白質(zhì)的過敏反應(yīng)[13],但至今未見牡蠣AK動物致敏模型的相關(guān)報道。過敏食物評價的常用動物模型有BALB/c小鼠、棕色挪威大鼠、豚鼠等,BALB/c小鼠體積小,繁殖周期短,過敏原刺激后偏向Th2型細胞應(yīng)答且可以產(chǎn)生高效價的IgE,所以選擇該品系小鼠為IgE介導(dǎo)過敏反應(yīng)的研究對象[14-15]。小鼠的給藥途徑包括口服灌胃、腹腔注射和表皮致敏,口服灌胃能更好地模擬人體經(jīng)口攝入食物過敏原的實際情況,不過容易誘導(dǎo)免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)霍亂毒素會使IL-4、IL-5顯著上升,而IL-2、IFN-γ基本無變化,并且能選擇性發(fā)生以Th2為主的過敏反應(yīng),所以將它作為黏膜佐劑可有效克服耐受現(xiàn)象[16]。綜上所述,本實驗利用提取純化的牡蠣AK和無毒的霍亂毒素B亞基(cholera toxin B subunit,CTB)致敏雌性BALB/c小鼠,通過觀察BALB/c小鼠的全身主動過敏反應(yīng)及體重,測定其血清中總IgE(tIgE)、特異性IgE(sIgE)水平和血漿中血項含量的變化,對空腸、肝臟、脾臟和腎臟進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后觀察病理變化,對空腸進行甲苯胺藍染色來觀察肥大細胞脫顆粒情況,初步建立牡蠣AK BALB/c小鼠過敏模型,為理解貝類過敏的有關(guān)免疫機制和研發(fā)預(yù)防及治療食物過敏的藥物及治療策略提供有價值的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雌性BALB/c小鼠,6周齡,30只,維通利華動物公司,許可證號為SYXK(京)2017-0033；牡蠣AK經(jīng)過提取純化獲得；小鼠IgE酶聯(lián)免疫試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgE、抗凝劑EDTA-K2、TMB顯色液、重組霍亂毒素B亞基,碧云天公司。以下所有實驗得到中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院福利倫理委員會的批準(批準文號：2019—0002)。

1.2 實驗方法

1.2.1 BALB/c小鼠的致敏

雌性BALB/c小鼠適應(yīng)1周后將其隨機分為實驗組(20只)和PBS對照組(10只),致敏前取血作為陰性血清。使用口服灌胃與腹腔注射牡蠣AK兩種方式對實驗組小鼠進行致敏(如圖1)：在第0、8、16、24、32、40天,實驗組每只灌胃含有10 μg CTB及600 μg AK的200 μL PBS進行致敏；在第4、12、20、28、36天腹腔注射200 μL相同劑量的AK和CTB。在第45天用6 mg/mL的AK(200 μL)分別進行灌胃和腹腔注射激發(fā)。對照組灌胃等體積PBS(pH 7.4),步驟相同。分別于第16、28、36、40、45天內(nèi)取血,離心收集血清,用于檢測tIgE、sIgE；同時于第16、36、45天取血于7.5% EDTA-K2抗凝管中,離心收集血漿并冷凍于-80 ℃,用于測定血項水平的變化。

圖1 BALB/c小鼠的致敏流程

Fig.1 Sensitization procedure of BALB/c mice

1.2.2 BALB/c小鼠的全身主動過敏反應(yīng)評估

在第45天通過灌胃和腹腔注射高濃度牡蠣AK進行激發(fā),激發(fā)后20～60 min進行體溫測量,仔細察看小鼠全身過敏反應(yīng)現(xiàn)象,同時根據(jù)過敏評分表(表1)確定其表型過敏級數(shù)[17-18]。

表1 過敏反應(yīng)級數(shù)

Table 1 Allergy reaction grade

平均過敏級數(shù)達到2級即確定發(fā)生表型過敏反應(yīng)。平均反應(yīng)級數(shù)和過敏率按公式(1)(2)計算：

(1)

(2)

式中：平均過敏級數(shù)；Ad,過敏級數(shù)；RA,過敏率,%；n,過敏動物數(shù)量；N,總動物數(shù)量。

1.2.3 BALB/c小鼠體重和血項指標變化

致敏期間每2周稱體重,計算平均體重。第16、36、45天分別取血于含有抗凝劑EDTA-K2的抗凝管中,使用血細胞分析儀對血漿中白細胞、中性粒細胞和嗜酸性細胞這3種血項指標進行計數(shù)。

1.2.4 tIgE、sIgE水平的檢測

利用間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測量BALB/c小鼠血清中sIgE,用質(zhì)量濃度為50 μg/mL的牡蠣AK包被96孔板,4 ℃孵育過夜；添加300 μL/孔的5%脫脂奶粉(質(zhì)量分數(shù),下同)37 ℃封閉1 h；再取100 μL 2%脫脂奶粉稀釋的BALB/c小鼠血清(1∶5)加入孔中,室溫下孵育3 h；每孔添加100 μL HRP標記的山羊抗小鼠IgE(1∶2 000),37 ℃孵育1 h；用200 μL TMB避光孵育20 min,然后添加50 μL 2 mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng),用酶標儀于450 nm測量OD值。每兩步之間都用PBST洗滌4次,所有實驗均重復(fù)3次。使用ELISA試劑盒對BALB/c小鼠血清tIgE水平進行測定。

1.2.5 BALB/c小鼠臟器、腸道病理學(xué)分析

第45天激發(fā)采血后,處死小鼠,取其空腸、肝臟、脾臟、腎臟,放入10%的多聚甲醛固定后修剪；用不同濃度梯度的乙醇進行脫水處理,石蠟包埋后切片并進行HE染色,用顯微鏡觀察組織形態(tài)；空腸甲苯胺藍染色后觀察其肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS及OriginPro 8.0處理實驗數(shù)據(jù),組間檢驗采用t檢驗,P<0.01差異極顯著(用**表示)；P<0.05差異顯著(用*表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BALB/c小鼠的全身主動過敏反應(yīng)結(jié)果

第45天口服激發(fā)30 min后,實驗組表現(xiàn)出0～4級過敏癥狀(圖2),其中有7只BALB/c小鼠不斷對鼻子、耳朵、頭周圍及腹部進行抓撓,有5只眼或口周圍出現(xiàn)浮腫且毛發(fā)豎立；4只經(jīng)常喘息、側(cè)臥,有3只對外界刺激反應(yīng)遲鈍并伴有顫抖癥狀,僅有1只無明顯癥狀；對照組BALB/c小鼠均未出現(xiàn)過敏癥狀。盡管小鼠在不同過敏級別的數(shù)量上存在一些差異,但表明通過灌胃和腹腔注射AK的BALB/c小鼠從表型來看發(fā)生了過敏反應(yīng),且過敏率為95%。

圖2 BALB/c小鼠的過敏反應(yīng)級數(shù)

Fig.2 Allergic reaction level of BALB/c mice

2.2 BALB/c小鼠體重和血項指標變化

2.2.1 BALB/c小鼠體重變化

體重變化情況如圖3所示,所有BALB/c小鼠體重均逐漸增長,但與對照組相比,實驗組體重增加緩慢。在0～14 d內(nèi)差異不明顯,之后實驗組小鼠體重明比對照組輕,第42天兩者平均體重差約0.5 g。這可能是因為過敏反應(yīng)使其消化吸收系統(tǒng)功能紊亂,影響了小鼠的健康狀態(tài),所以體重增長趨勢平緩。

圖3 BALB/c小鼠體重變化

Fig.3 Body weight changes of BALB/c mice

2.2.2 BALB/c小鼠血項指標變化情況

當(dāng)同種過敏原再次進入處于致敏狀態(tài)的機體時,機體內(nèi)細胞會隨之產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng),從而引起白細胞數(shù)目及分類的變化。白細胞是不均一的細胞群,按照其形態(tài)、功能和來源部位分為：粒細胞、單核細胞和淋巴細胞,粒細胞包括中性粒細胞(桿狀核及分葉核)、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞,不同類型的白細胞以不同形式在機體中發(fā)揮防衛(wèi)作用[19]。從表2可知,隨著致敏時間的增加,實驗組小鼠白細胞數(shù)量也逐漸增加,而對照組基本無變化,在第36、45天呈現(xiàn)出顯著性升高,這說明BALB/c小鼠在免疫期間一直處于過敏狀態(tài)。實驗組中性粒細胞在第45天呈現(xiàn)出顯著差異,嗜酸性粒細胞在第36天開始呈現(xiàn)出極顯著差異,這兩種粒細胞數(shù)量整體呈增加趨勢。嗜酸性粒細胞在過敏反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用,該細胞會釋放有毒的顆粒蛋白和脂質(zhì)介質(zhì),引起組織損傷和功能障礙,加劇炎癥反應(yīng),但也能吞噬抗原抗體復(fù)合物[20]。這3種血項指標的變化也進一步說明了實驗組BALB/c小鼠對AK產(chǎn)生過敏反應(yīng)。

表2 BALB/c小鼠血項指標變化

Table 2 Changes in blood index of BALB/c mice

2.3 血清中tIgE、sIgE的含量變化

2.3.1 血清中tIgE的含量

I型過敏機制由IgE介導(dǎo),如圖4所示,隨著免疫時間的增加,實驗組小鼠體內(nèi)tIgE水平也不斷升高,對照組基本維持在11 μg/mL左右。與對照組相比,第28天實驗組的tIgE含量開始明顯增加,之后呈上升趨勢,到第45天激發(fā)后實驗組血清中tIgE水平達到41.06 μg/mL,幾乎是對照組的4倍。此外,與第16天比較后,實驗組第45天tIgE含量表現(xiàn)出極顯著的升高。免疫期間實驗組tIgE不斷增加,對照組不變,證明實驗組BALB/c小鼠處于較嚴重的過敏狀態(tài)。

圖4 BALB/c小鼠血清總IgE含量

Fig.4 Total serum IgE content in BALB/c mice

2.3.2 血清中sIgE水平測定

血清中sIgE含量是評價過敏原致敏性的重要檢測指標。圖5顯示的是BALB/c小鼠在不同階段的血清sIgE水平變化情況,通過對血清sIgE抗體的檢測,能夠確定引發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原種類和致敏效果。從第16天到第45天,實驗組sIgE抗體含量逐漸升高,且明顯高于正常值。在激發(fā)實驗后,與對照組sIgE含量相比有顯著提高。因此,BALB/c小鼠的過敏反應(yīng)是由牡蠣AK引起的。

圖5 BALB/c小鼠的sIgE變化

Fig.5 sIgE changes in BALB/c mice

將牡蠣過敏患者血清與BALB/c小鼠致敏血清的sIgE含量相比(圖6),發(fā)現(xiàn)患者、小鼠的致敏血清與對照組對比后都出現(xiàn)極顯著增加,但患者和鼠的過敏血清無顯著性差異,從而成功獲得其種屬特異性AK致敏血清。

RC-對照組BALB/c小鼠血清；R-實驗組BALB/c小鼠血清；HC-正常人血清；H-對牡蠣過敏的人血清

圖6 人和BALB/c小鼠的sIgE比較

Fig.6 Comparison of sIgE between human and BALB/c mice

2.4 組織病理學(xué)染色分析

空腸、脾臟、肝臟、腎臟的組織切片如圖7所示,對照組小鼠各臟器組織結(jié)構(gòu)正常,基本無明顯病理改變(圖7-a1～圖7-d1)。實驗組肝臟中央靜脈和肝竇都明顯擴張充血,一些肝細胞索斷開、收縮且使血液相互融合從而產(chǎn)生淤血帶(圖7-a2)。實驗組腸絨毛上皮脫落、紊亂,腸黏膜間質(zhì)中炎細胞局部浸潤,血管充血水腫,組織疏松(圖7-b2)。有研究發(fā)現(xiàn),在鼠灌胃致敏模擬食物過敏中,其腸道產(chǎn)生過敏癥狀,慢性炎癥導(dǎo)致屏障功能的調(diào)節(jié)和上皮滲透性的增加,小腸組織造成損傷,從而使腸道攝取更多的免疫完整的大分子[21]。實驗組脾臟紅髓部分充血,邊緣竇有許多淋巴灶(圖7-c2)。模型組腎臟患腎小球炎,血管球成分葉狀,基底膜稍有增厚,炎癥細胞增加(圖7-d2)。這也許是因為過敏反應(yīng)產(chǎn)生許多嗜酸性粒細胞,進入腎臟后使BALB/c小鼠的器官發(fā)生病變。

a-肝臟HE染色；b-空腸HE染色；c-脾臟HE染色；d-腎臟HE染色；e-空腸甲苯胺藍染色；1-對照組；2-實驗組

圖7 器官HE與甲苯胺藍染色結(jié)果

Fig.7 Results of organ HE and toluidine blue staining

空腸組織經(jīng)甲苯胺藍染色后如圖7-e所示,肥大細胞顆粒呈藍紫色,胞核為藍色。對照組的小鼠腸道(圖7-e1)固有層肥大細胞較少、胞膜完整、輪廓清晰,只有很小一部分脫顆粒,而模型組的腸(圖7-e2)固有層肥大細胞增加,很多肥大細胞脫顆粒后胞膜破損、輪廓模糊。肥大細胞是I型過敏反應(yīng)的重要效應(yīng)細胞,IgE由B細胞受抗原刺激后分泌,肥大細胞表面的FcεR I受體能夠結(jié)合IgE的Fc片段,當(dāng)抗原再次入侵時,IgE的Fab片段識別和結(jié)合抗原,抗原、IgE和FcεR I之間的交聯(lián)導(dǎo)致肥大細胞釋放顆粒[22-23]。所以肥大細胞脫顆粒是過敏反應(yīng)研究的主要階段,其數(shù)量及脫顆粒情況能夠良好的反映組織過敏情況。病理觀察表明實驗組BALB/c小鼠空腸已產(chǎn)生明顯的過敏現(xiàn)象。

3 結(jié)論

由于經(jīng)濟全球化和人類飲食結(jié)構(gòu)的改變,牡蠣引起的過敏性疾病發(fā)病率正逐漸增加,這對人們的身體健康和生活質(zhì)量形成了極大的威脅。本研究利用天然牡蠣AK通過經(jīng)口灌胃與腹腔注射結(jié)合并添加CTB佐劑的方式致敏BALB/c小鼠,同時從表型過敏級數(shù)、體重方面證明實驗組小鼠已產(chǎn)生過敏反應(yīng),而且也許因為過敏反應(yīng)使臟器受到損傷影響了小鼠的消化吸收,導(dǎo)致部分體重比對照組低,實驗組血項指標均呈現(xiàn)升高趨勢。另外,免疫期間模型組tIgE和sIgE水平也顯著增多,組織病理學(xué)分析結(jié)果說明模型組臟器均出現(xiàn)組織損傷,空腸肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象嚴重。本實驗成功建立并分析了牡蠣AK小鼠致敏模型,獲得了AK動物致敏血清,并從整體動物水平和形態(tài)學(xué)角度證明了牡蠣AK的致敏性。通過AK建立BALB/c小鼠致敏模型對研究食物過敏的致敏機制及臨床上預(yù)防及治療食物過敏具有重要的理論意義。接下來將建立細胞模型并對Th2型淋巴細胞水平及其相關(guān)細胞因子的質(zhì)量濃度和通路進行詳細研究。