基于碳、氮同位素和礦物元素的青蘿卜產(chǎn)地判別

蘿卜一詞最早在中國古代專著《爾雅》被提及，稱其為“蘆菔”。青蘿卜是十字花科蘿卜屬一種常見的根莖類蔬菜，種植歷史悠久，可生食、做湯、干腌和鹽漬等，不僅富含人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有一定藥用價值[1-3]。但是，由于不同地理來源的青蘿卜維生素C含量、外形、口感等存在差異，例如天津的沙窩蘿卜通常以水果蘿卜出名[4]，消化功能顯著，而山東濰坊的浮橋蘿卜鈣含量豐富。這類特色農(nóng)產(chǎn)品因其特殊的文化和自然因素、較高的口碑和經(jīng)濟(jì)價值，易遭遇摻假和假冒。因此，研究建立精準(zhǔn)的青蘿卜產(chǎn)地溯源技術(shù)體系，對判別青蘿卜真實(shí)來源、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、規(guī)范市場秩序尤為重要。

目前在農(nóng)產(chǎn)品地理溯源方面常用到的產(chǎn)地判別技術(shù)包括礦物元素分析技術(shù)、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)及電子鼻技術(shù)等[5-7]。生物在生長的過程中受氣候、海拔和土壤性質(zhì)等環(huán)境因素的影響，不同產(chǎn)地的農(nóng)產(chǎn)品體內(nèi)穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量呈現(xiàn)出獨(dú)特性和差異性，具有明顯的地域特征[8-9]，因此，礦物元素分析技術(shù)、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源中具備較高的應(yīng)用價值，并且這兩項(xiàng)技術(shù)具有前處理操作簡單、判別模型精準(zhǔn)度高等優(yōu)點(diǎn)，在眾多特色地標(biāo)農(nóng)產(chǎn)品中被廣泛應(yīng)用[10]。連思雨等[11]和BERTOLDI等[12]通過測定枸杞中的穩(wěn)定同位素、礦物元素等成分，結(jié)合主成分分析(principal components analysis，PCA)、偏最小二程判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)等化學(xué)計量方法建立判別模型，準(zhǔn)確率高達(dá)95%以上；MA等[13]和王潔[14]基于礦物元素、礦物元素與穩(wěn)定同位素比率結(jié)合等方式對扁形茶、龍井茶的產(chǎn)地溯源技術(shù)進(jìn)行探究，建立高精準(zhǔn)度的鑒別模型，進(jìn)一步肯定這2項(xiàng)技術(shù)在產(chǎn)地判別方面的作用；此外，礦物元素分析技術(shù)、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)等在谷物[15-17]、果蔬[18-19]以及藥材[20-21]、水產(chǎn)品[22-24]等眾多領(lǐng)域有著廣泛且高效的應(yīng)用，但在蘿卜地理來源的鑒別方面鮮有應(yīng)用研究。

本研究結(jié)合當(dāng)前產(chǎn)地研究的現(xiàn)狀，選取山東、天津、河南3個省份具有地理標(biāo)志認(rèn)證的10個品種青蘿卜，通過測定穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量，開展青蘿卜地理信息的相關(guān)性研究與應(yīng)用，并結(jié)合PLS-DA、線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)等化學(xué)計量學(xué)方法建立判別模型。旨在服務(wù)“三品一標(biāo)”，為保護(hù)青蘿卜產(chǎn)品品種、品質(zhì)、品牌以及提高經(jīng)濟(jì)效益提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集地理來源真實(shí)可靠的青蘿卜樣品177份，其中天津57份，河南59份、山東61份，具體信息如表1所示。穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)USGS43(δ13C=-21.34‰，δ15N=+8.44‰)，美國地質(zhì)勘探局Reston穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室；元素國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)菠菜GSBW10015，地球物理地球化學(xué)勘查研究所；元素標(biāo)液為電感耦合等離子體分析用多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液GNM-M311129-2013，國家有色金屬及電子材料分析測試中心逐級稀釋配得；濃硝酸(65%)，美國默克制藥。

表1 青蘿卜樣本基本信息
Table 1 The basical information of the green turnip samples

1.2 儀器與設(shè)備

Flash 2000元素分析儀、Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾公司；NEXION 300X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國珀金埃爾默股份有限公司；破壁機(jī)E310，美國Vitamix公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

青蘿卜樣品采集后，在實(shí)驗(yàn)室用自來水將泥土清洗、陰干后，測定單個重量、長度等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。四分法分取蘿卜樣品并切塊，用破壁機(jī)將樣品勻漿粉碎，分取100 g勻漿后的樣品放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥(-50 ℃)12 h以上，干燥后樣品放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 穩(wěn)定同位素測定

碳、氮同位素比值的測定：取0.2 mg青蘿卜粉末樣品于錫杯(5 mm×8 mm)中壓實(shí)包好后直接放入元素分析儀自動進(jìn)樣器中，在高溫下燃燒、還原，最終生成氣體，按N2、CO2的順序先后進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。進(jìn)樣序列中每隔10個樣品插入一個標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)量控制，樣品穩(wěn)定同位素比值應(yīng)用標(biāo)物進(jìn)行單點(diǎn)校正。儀器標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.2‰。

儀器工作參數(shù)：氧化管溫度為1 150 ℃，還原管溫度為850 ℃，通氧時間為70 s，元素分析儀氦氣吹掃流量為230 mL/min，進(jìn)入質(zhì)譜儀氦載氣流量為100 mL/min，高純N2、CO2(純度>99.999%)為參考?xì)狻?/p>

1.3.3 元素測定

用電子天平準(zhǔn)確稱量0.3 g各產(chǎn)地青蘿卜凍干粉末樣品于消解罐中，每個樣品3個平行。向消解罐中加入10 mL濃硝酸，過夜，第2天不蓋蓋子在智能石墨消解爐中進(jìn)行120 ℃石墨消解至澄清，約4 h，冷卻至室溫后從微波消解儀中取出，用少量去離子水分3次洗滌消解管，合并洗滌液及消解液，并定容至25 mL，進(jìn)行上機(jī)檢測。

儀器工作參數(shù)：電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)每次測定前均進(jìn)行自動調(diào)諧，根據(jù)儀器的狀態(tài)對參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以滿足靈敏度、氧化物、穩(wěn)定性等各項(xiàng)指標(biāo)。儀器調(diào)諧完畢后，將內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管插入1 μg/mL 內(nèi)標(biāo)溶液中進(jìn)行矯正，樣品管依次插入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行制作標(biāo)曲，最后測定樣品。射頻功率1 230 W；載氣流速1.21 L/min；Babington霧化器，霧化室溫度2 ℃；蠕動泵轉(zhuǎn)速0.1 r/s。用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。儀器調(diào)諧完畢后，將內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管插入1 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液中(分析過程中始終進(jìn)內(nèi)標(biāo)溶液)，樣品管依次插入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度依次遞增)和待測樣中進(jìn)行測定。

1.4 多元統(tǒng)計分析

應(yīng)用Origin 8.0軟件對碳、氮穩(wěn)定同位素進(jìn)行箱線圖分析，并應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，最后分別以所測青蘿卜中18種礦物元素為變量，應(yīng)用SIMCA-P 13.0分析軟件進(jìn)行PLS-DA建模，應(yīng)用MPP軟件結(jié)合LDA算法建立青蘿卜產(chǎn)地判別模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)青蘿卜多種礦質(zhì)元素含量和穩(wěn)定同位素比值分析

本研究共測定天津、河南、山東3個省份177份青蘿卜樣品中的碳、氮同位素比值和18種礦物元素的含量。

首先通過箱線圖對不同地區(qū)的穩(wěn)定同位素值進(jìn)行分析，如圖1所示。從整體分析，天津、河南、山東3個省份的青蘿卜樣品中的δ15N值為0.37‰～2.37‰，且均有重合，差異較小，天津和山東兩省樣本δ15N值范圍較廣，河南樣本的δ15N值范圍較為集中；山東、天津、河南3個省份的青蘿卜樣品δ13C值分布也顯示整體差異不顯著，范圍為-29.68‰～-27.88‰；從不同省份不同地區(qū)樣品細(xì)分發(fā)現(xiàn)，天津省的武清、西青兩個地區(qū)蘿卜的δ15N值存在差異，河南省固始縣與上蔡縣、固始縣與郟縣間的δ15N值存在差異，山東壽光和濰城、滕州兩個地區(qū)δ15N值存在差異；但不同地區(qū)樣品間δ13C值并未存在顯著差異。這表示碳、氮同位素在判別不同省份的青蘿卜時判別貢獻(xiàn)率較低，但δ15N值對進(jìn)一步精確鑒別小產(chǎn)區(qū)青蘿卜的地理來源時可能會具有相對顯著貢獻(xiàn)，這與當(dāng)?shù)氐耐寥罈l件、施肥狀況以及農(nóng)藥使用情況有關(guān)，可為今后進(jìn)一步研究青蘿卜的產(chǎn)地提供依據(jù)。

A-不同省份δ13C值范圍；B-不同省份δ15N值范圍；C-不同亞地區(qū)δ13C值范圍；D-不同亞地區(qū)δ15N值范圍
圖1 不同地區(qū)青蘿卜樣品C、N同位素比值分析
Fig.1 Analysis of C and N isotope ratios of green turnip samples from different regions

其次，應(yīng)用SPSS對所測定的18種礦物元素進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，由表2可知，天津、河南、山東3個省份的整體元素含量分為3個梯度，Na、Ca、P、Mg 4種元素含量較高，平均含量均超過1 000 mg/kg，且Na、Ca、Mg 3種元素在不同省份間均存在顯著差異，天津地區(qū)青蘿卜樣品中Na含量最高，達(dá)10 786 mg/kg，河南地區(qū)Ca含量最高為6 182.05 mg/kg，山東地區(qū)Mg含量最高為2 237.28 mg/kg；Fe、Sr、Zn、B、Ba、Mn、Cu相對較低，但整體元素含量均高于1 mg/kg，F(xiàn)e、Sr、Zn、B、Mn 5種元素在天津、河南、山東3個省份間均存在明顯差異；Mo、Cr、Ni、Se、Cd、As、Co 7種元素含量最低，平均含量小于1 mg/kg，其中只有As在不同省份間差異顯著(P<0.05)。

2.2 判別分析

植物中穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量的差異反映了其生長的環(huán)境及氣候條件，為進(jìn)行產(chǎn)地溯源、建立模型提供了依據(jù)。由圖2分析結(jié)果可知，不同地區(qū)青蘿卜中的碳、氮同位素整體差異范圍小，因此，本研究在進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源時，采用礦物元素含量和

表2 不同地區(qū)青蘿卜元素含量分析 單位：mg/kg

Table 2 The analysis of element content in green turnip from different areas

注：不同小寫字母表差異顯著(P<0.05)

化學(xué)計量學(xué)方法結(jié)合的方式建立青蘿卜樣品的判別模型。目前，在產(chǎn)地溯源的研究中常用到的化學(xué)計量學(xué)方法主要包括PCA、PLS-DA、支持向量機(jī)(support Vector Machine，SVM)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(back propagation-artificial neural network，BP-ANN)以及LDA等。本文對青蘿卜樣品中的礦物元素含量進(jìn)行分析，結(jié)合PCA-X、PLS-DA、LDA 3種算法建立產(chǎn)地判別模型。

圖2 三個產(chǎn)地青蘿卜VIP值
Fig.2 The results of VIP in green turnip from different producing areas

2.2.1 PLS-DA

PLS-DA是一種有監(jiān)督的識別方法，它既可以實(shí)現(xiàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，同時可以結(jié)合回歸模型利用一定的判別閾值對回歸結(jié)果進(jìn)行判別分析，同時因其所建的模型比較穩(wěn)定，且具有很強(qiáng)的抗干擾能力，目前建立產(chǎn)地判別模型時被廣泛應(yīng)用。對所有青蘿卜樣品按照省份進(jìn)行分組，分為天津、河南和山東3個組別，提取青蘿卜樣品中5個主成分應(yīng)用PLS-DA算法結(jié)合礦物元素含量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，如圖2元素VIP貢獻(xiàn)值圖看出，Cr、Ca、Na、Mg、Ni、Cd共6種元素在青蘿卜判別時貢獻(xiàn)率較大。其中Ca、Na、Mg 3種元素與2.1中單因素ANOVA檢驗(yàn)的判別結(jié)果一致。如圖3所示，由3個省份二維模型圖可以看出，天津樣品、河南樣品以及山東樣品3個省份的青蘿卜之間均有不同程度的重合，在判別時，天津僅有2個被誤判為山東樣品，山東樣品僅有1個被誤判為天津，不同省份樣品未發(fā)生明顯聚集。因此，基于青蘿卜礦物元素含量結(jié)合PLS-DA算法建立天津、山東、河南3個省份的青蘿卜樣品判別模型具有一定的實(shí)際應(yīng)用意義。

圖3 蘿卜樣品PLS-DA歸類判別
Fig.3 Classification of green turnip from different producing areas by PLS-DA model

2.2.2 LDA

LDA是一種有監(jiān)督判別方法，以投影后類內(nèi)方差最小，類間方差最大的原則對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，實(shí)現(xiàn)樣品的分類。應(yīng)用LDA算法對3個省份的青蘿卜樣品中18種礦物元素進(jìn)行統(tǒng)計分析，建立判別模型。結(jié)果如圖4所示，在進(jìn)行模型驗(yàn)證時，河南有4個樣品被誤判為山東樣品，在山東樣品判別時，分別有3個青蘿卜樣品被誤判為河南，2個青蘿卜樣品被誤判為天津，天津57個青蘿卜樣品52個均能被準(zhǔn)確判別，僅有5個被誤判為山東樣品。河南樣品和天津樣品都容易誤判為山東，這與箱線圖的分析結(jié)果相符。由表3可知，應(yīng)用PLS-DA對青蘿卜進(jìn)行產(chǎn)地判別模型，天津蘿卜的預(yù)判效果較好，模型驗(yàn)證和交叉訓(xùn)練時模型的判別率為91.23%，但河南和山東樣品在模型中識別準(zhǔn)確率較低；采用LDA算法建模，3個省份模型的驗(yàn)證集和訓(xùn)練集判別率均在90%以上，表明LDA算法在進(jìn)行蘿卜產(chǎn)地溯源時的判別時的效果明顯高于PLS-DA，在模型訓(xùn)練時整體判別率為93.79%，且Ca、Na、Mg元素在建模時依舊顯示較大貢獻(xiàn)率。

圖4 三個產(chǎn)地青蘿卜樣品LDA歸類判別
Fig.4 Classification of green turnip from different producing areas by LDA model

表3 LDA和PLS-DA模型預(yù)測準(zhǔn)確率 單位：%

Table 3 The accuracy of LDA and SVM models

目前，王游游等[25]對絕明子產(chǎn)地溯源時發(fā)現(xiàn)，δ15N值、δ13C值等穩(wěn)定同位素和礦物元素結(jié)合對鑒別決明子產(chǎn)區(qū)有更加顯著的效果，篩選出具有顯著差異的19種礦物元素以及其中重要權(quán)重因子，肯定δ15N 值對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地判別時的貢獻(xiàn)，并提出礦物元素對產(chǎn)地判別的效果明顯優(yōu)于同位素；楊健等[26]發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定同位素可單獨(dú)達(dá)到鑒別何首烏產(chǎn)地的效果，但穩(wěn)定同位素結(jié)合元素的模型判別率得到進(jìn)一步提高；本文在分析青蘿卜樣品中的礦物元素含量以及同位素比值時，同樣發(fā)現(xiàn)礦物元素對產(chǎn)地判別的效果明顯優(yōu)于穩(wěn)定同位素，且單獨(dú)應(yīng)用礦物元素對天津、山東、河南3個地區(qū)的青蘿卜樣品的判別率均在90%以上。因此，本文建立青蘿卜樣品的產(chǎn)地判別模型進(jìn)一步肯定了礦物元素在青蘿卜產(chǎn)地鑒別中的實(shí)際應(yīng)用意義，精簡進(jìn)行青蘿卜溯源需要測定的變量，這為未來青蘿卜產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

3 結(jié)論

本研究通過測定天津、河南、山東3個省份不同地區(qū)青蘿卜樣品中的穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量，首次為青蘿卜建立了產(chǎn)地鑒別模型。研究發(fā)現(xiàn)，這3個產(chǎn)地的樣品有明顯的地域分布特征，箱線圖分析、單因素ANOVA檢驗(yàn)表明，元素在進(jìn)行青蘿卜產(chǎn)地判別的貢獻(xiàn)明顯高于碳、氮穩(wěn)定同位素，18種礦物元素中，Na、Ca、Mg共3種元素在結(jié)合不同的化學(xué)計量學(xué)方法分析時均表現(xiàn)出顯著差異性。PLS-DA算法建立判別模型時，對山東和天津的樣品識別率較低，對天津樣品識別率較高，模型訓(xùn)練整體判別率僅為86.44%；應(yīng)用LDA算法進(jìn)行產(chǎn)地鑒別時，模型對天津、河南、山東青蘿卜樣品的識別率均較高，模型在驗(yàn)證和訓(xùn)練的總體判別率分別為92.09%和93.79%。2種化學(xué)計量學(xué)方法進(jìn)行判別分析的結(jié)果顯示，LDA對不同省份樣品的區(qū)分效果明顯優(yōu)于PLS-DA算法。本文首次對青蘿卜樣品的礦物元素和穩(wěn)定同位素進(jìn)行分析，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法建立的產(chǎn)地判別模型，LDA算法在建模過程中表現(xiàn)良好。根據(jù)青蘿卜不同產(chǎn)地之間的差異性建模，礦物元素結(jié)合LDA算法的效果理想，可為下一步青蘿卜產(chǎn)地溯源技術(shù)的研究提供新的研究方向和理論依據(jù)。