β-丙氨酸合成方法的研究進(jìn)展

β-丙氨酸(β-alanine，C3H7NO2)，易溶于水，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。與組成人體蛋白質(zhì)20種氨基酸之一的α-丙氨酸互為同分異構(gòu)體。β-丙氨酸作為一種非蛋白氨基酸，可以在微生物、植物和昆蟲(chóng)體內(nèi)合成，而哺乳動(dòng)物需從外界環(huán)境中攝取[1-2]。β-丙氨酸廣泛被應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、化工和環(huán)境等領(lǐng)域。首先，工業(yè)上很多重要化合物如：3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid)、聚3-羥基丙酸酯(poly 3-hydroxypropionate)、泛酸(pantothenic acid)、肌肽(carnosine)、帕米膦酸鈉(pamidronate)和巴柳氮(balasalazide)等是以β-丙氨酸為重要前體或中間體合成的[3-7]。其次，在食品行業(yè)中，β-丙氨酸既是一種食品添加劑改善食品味道，還被作為運(yùn)動(dòng)員營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，改善身體機(jī)能[8-9]。此外，它還可以直接用于生產(chǎn)聚β-丙氨酸，廣泛應(yīng)用于化妝品、水凈化和建筑等領(lǐng)域[10-11]。

近年來(lái)β-丙氨酸系列產(chǎn)品的全球需求量約為5萬(wàn)t，且仍在不斷增加，預(yù)計(jì)到2023年全球市場(chǎng)需求可達(dá)8.1萬(wàn)t，被稱(chēng)為未來(lái)全球12種最具開(kāi)發(fā)潛力的三碳化工產(chǎn)品之一[12]。世界上β-丙氨酸主要通過(guò)化學(xué)法、生物酶轉(zhuǎn)化法以及微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。其中反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，目前已經(jīng)報(bào)道的最高產(chǎn)量為43.12 g/L[13]。但是該水平還達(dá)不到工業(yè)化水平。值得注意的是，L-天冬氨酸-α-脫羧酶(L-asparatate-α-decarboxylase，EC4.1.1.11 PanD)是酶法與微生物發(fā)酵法合成β-丙氨酸的關(guān)鍵，該酶通過(guò)催化一分子L-天冬氨酸脫去α位羧基釋放一分子CO2，生成β-丙氨酸，是影響β-丙氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。近年來(lái)對(duì)PanD的蛋白晶體結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)以及催化機(jī)制也有了深入的研究，對(duì)其過(guò)表達(dá)和改造也是催化法提高β-丙氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。

近年來(lái)，隨著β-丙氨酸市場(chǎng)需求量逐年增加，對(duì)β-丙氨酸產(chǎn)量方面的研究也越來(lái)越多。本文將通過(guò)對(duì)近幾年β-丙氨酸的合成方法及過(guò)程、代謝工程、調(diào)控機(jī)制和關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展進(jìn)行全面綜述，為β-丙氨酸合成產(chǎn)量的進(jìn)一步提高提供基礎(chǔ)。

1 β-丙氨酸的合成方法

目前，β-丙氨酸的生產(chǎn)主要包括化學(xué)合成法、生物酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。不同的方法具有不同的優(yōu)勢(shì)及劣勢(shì)，具體如表1所示。

表1 不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較
Table 1 Comparison of the advantages and disadvantages of different methods

1.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是現(xiàn)在β-丙氨酸大規(guī)模生產(chǎn)的主要方法。按照合成原料的不同，合成β-丙氨酸的方法主要有丙烯酸法、丙烯腈法、β-氨基丙腈法、琥珀酰亞胺法等。其中丙烯酸法和丙烯腈法為國(guó)內(nèi)廠家使用最廣泛的方法。

丙烯酸法是以丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸鹽為底物，與氨水氨化反應(yīng)，得到產(chǎn)物β-丙氨酸(圖1-a)，是理想的工業(yè)化方法[7]，但此方法需要較高的溫度和壓力。裘娟萍等[14]通過(guò)將底物丙烯酸加入種子培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)基中，在酶催化的作用下生成β-丙氨酸，經(jīng)過(guò)脫氨、純化，最終β-丙氨酸的轉(zhuǎn)化率分別為60%和54%。氨化助劑的使用及生產(chǎn)方式的選擇直接影響β-丙氨酸產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。馬銘澤等[15]通過(guò)加氨化助劑(CO2)+連續(xù)生產(chǎn)的生產(chǎn)方式，將產(chǎn)物β-丙氨酸的轉(zhuǎn)化率提高到96%。除此之外，以丙烯酸和氨水為底物，利用高分子化合物載體(氨基樹(shù)脂)對(duì)天冬氨酸酶進(jìn)行固定化，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、脫色、蒸發(fā)濃縮以及脫水干燥步驟，最終丙烯酸合成β-丙氨酸的轉(zhuǎn)化率為95.66%，純度達(dá)到99.61%[16]。

丙烯腈法是以丙烯腈為底物通過(guò)直接氨化或氨化水解合成β-丙氨酸的方法，其中直接氨化法是高溫、高壓的條件下，丙烯腈與氨水發(fā)生氨化反應(yīng)生成β-丙氨酸(圖1-b)。氨化水解法是丙烯腈與氨水通過(guò)氨化反應(yīng)生成中間物質(zhì)β-氨基丙腈，后者在酸性(堿性)的條件下水解生成β-丙氨酸(圖1-c)[7]。

另外，在減壓條件下通過(guò)堿性溶液(氫氧化鈉)與β-氨基丙腈反應(yīng)生成中間產(chǎn)物β-氨基丙氨酸鈉，再向反應(yīng)罐中加入酸性溶液(鹽酸)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH(7～7.5)，最終生成β-丙氨酸，反應(yīng)液經(jīng)吸附、干燥等一系列操作得到純度為99.5%的β-丙氨酸成品[17]。隨后，采用相同的底物(氫氧化鈉與β-氨基丙腈)，通過(guò)微通道反應(yīng)器在高溫、高壓條件下底物發(fā)生瞬時(shí)水解反應(yīng)，得到含有β-丙氨酸的粗料液，后續(xù)通過(guò)脫氨系統(tǒng)、離子交換系統(tǒng)去除氨氣和鈉離子，再經(jīng)過(guò)濃縮結(jié)晶，最終β-丙氨酸純度達(dá)到99.5%以上，收率達(dá)到95%以上；此方法可減少能量的消耗，提高資源的利用率[18]。另一種琥珀酰亞胺法，相較于丙烯酸氨化法工藝路線復(fù)雜且反應(yīng)條件苛刻，原料成本更高，一般不采取該方法。

綜上所述，化學(xué)合成法生產(chǎn)β-丙氨酸的轉(zhuǎn)化率及純度均達(dá)到了95%以上，是β-丙氨酸合成方法中最具有競(jìng)爭(zhēng)力的合成方法。但化學(xué)合成法需要在高溫高壓強(qiáng)酸強(qiáng)堿等條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件比較極端。因此，尋求綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)工藝越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注。

a-丙烯酸氨化反應(yīng)；b-丙烯腈的氨化反應(yīng)； c-丙烯腈的氨化水解法
圖1 β-丙氨酸化學(xué)合成法
Fig.1 β-alanine chemical synthesis

1.2 生物酶轉(zhuǎn)化法

近幾十年來(lái)，隨著對(duì)綠色、可持續(xù)發(fā)展需求的增加，酶已經(jīng)成為傳統(tǒng)化學(xué)催化的一種很有前途的替代品，通過(guò)微生物細(xì)胞的胞內(nèi)酶與底物進(jìn)行反應(yīng)制備β-丙氨酸亦成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。它克服了傳統(tǒng)化學(xué)合成法的一些難題，如成本低、生產(chǎn)時(shí)間短、綠色可持續(xù)等。根據(jù)底物的不同，生產(chǎn)β-丙氨酸的生物酶轉(zhuǎn)化法可以分為腈水解酶轉(zhuǎn)化法(以β-氨基丙腈為底物)和PanD轉(zhuǎn)化法(以L-天冬氨酸為底物)。

1.2.1 腈水解酶轉(zhuǎn)化法

腈水解酶轉(zhuǎn)化法是以β-氨基丙腈為底物，該研究使用了一種可生產(chǎn)有機(jī)腈降解酶的微生物Alcaligenes sp. OMT-MY14，其以β-氨基丙腈為底物進(jìn)行水解反應(yīng)合成產(chǎn)物β-丙氨酸，使得β-丙氨酸最終產(chǎn)量達(dá)4.18 g/L[7]。梁璐怡等[19]從土壤中分離出1株能轉(zhuǎn)化β-氨基丙腈生產(chǎn)β-丙氨酸的菌株Rhodococcus erythropolis G20。亦有專(zhuān)利表明，來(lái)自Bradyrhizobium japonicum USDA110的blr3397基因所編碼的腈水解酶可催化β-氨基丙腈水解生成β-丙氨酸，產(chǎn)率達(dá)到76%[20]。

1.2.2 PanD轉(zhuǎn)化法

PanD是生物體合成β-丙氨酸的關(guān)鍵酶，該酶可高效催化底物L-天冬氨酸脫去α位置的羧基生成β-丙氨酸(圖2)，是β-丙氨酸生物酶轉(zhuǎn)化法的關(guān)鍵酶。近年來(lái)，大部分關(guān)于PanD的研究主要集中在原核生物，如大腸桿菌[10](Escherichia coli)、谷氨酸棒狀桿菌[21](Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢桿菌[22](Bacillus subtilis)和結(jié)核分枝桿菌[23](Mycobacterium tuberculosis)。ROCK等[24]首次利用E.coli中panD基因進(jìn)行突變，得到β-丙氨酸缺陷型突變菌株，證明PanD具有高效催化底物L-天冬氨酸生成產(chǎn)物β-丙氨酸的功能。K?NST等[25]使用PanD全細(xì)胞催化L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸，發(fā)現(xiàn)PanD具有非常高的耐熱性且沒(méi)有底物抑制。張瀟瀟[26]通過(guò)在宿主E.coli BL21(DE3)菌株中異源過(guò)表達(dá)頓齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)來(lái)源的panD基因，使β-丙氨酸的最終質(zhì)量濃度達(dá)到76.47 mg/L。SHEN等[21]則將C.glutamicum來(lái)源的panD基因在E.coli中進(jìn)行重組表達(dá)，純酶后催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸，最終β-丙氨酸產(chǎn)量為12.85 g/L。隨后，陳夏林[27]選擇了不同來(lái)源的44個(gè)panD基因，對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明杰氏棒桿菌(Corynebacterium jeikeium)來(lái)源的PanD的比酶活力為11.8 U/mg，是相關(guān)報(bào)道的最高水平。之后，范雪萍等[28]直接將特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)來(lái)源的panD基因在E.coli BL21(DE3)中重組表達(dá)，以200 g/L L-天冬氨酸作為底物，底物β-丙氨酸的最終產(chǎn)量達(dá)66.4 g/L。WANG等[29]共表達(dá)B.Subtilis和昆蟲(chóng)赤擬谷道(Tribolium castaneum)中的panD基因，利用全細(xì)胞生物催化劑從L-天冬氨酸獲得271.5 g/L的β-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率為92.4%。

圖2 PanD催化反應(yīng)方程式[26]
Fig.2 PanD catalytic reaction equation[26]

1.2.2.1 PanD的自剪切催化裂解機(jī)理

PanD在生物體內(nèi)主要包括2種形式：一類(lèi)是T.castaneum、果蠅(Drosophila melanogaster)等真核生物來(lái)源的磷酸吡哆醛依賴(lài)型，目前其蛋白結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理尚無(wú)明確報(bào)道[30-31]；另一類(lèi)是廣泛存在于原核生物如E.coli、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)及嗜熱菌(Thermus thermophiles)中的PanD，以丙酮酰基團(tuán)作為活性中心，這類(lèi)酶晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理已經(jīng)完成解析，且在β-丙氨酸的合成中被廣泛應(yīng)用，下面將重點(diǎn)介紹該類(lèi)PanD。

原核生物中的PanD在細(xì)胞內(nèi)首先以無(wú)活性的酶原形式表達(dá)，再進(jìn)一步通過(guò)自剪切形成亞基，其形成的亞基即活性基團(tuán)。以E.coli中的PanD(PanDEc)為例，PanDEc編碼蛋白會(huì)先形成一個(gè)非活性前體(通常叫做π蛋白)，隨后，π蛋白在Gly24-Ser25位置通過(guò)非水解絲氨酸作用分子內(nèi)發(fā)生自裂解，導(dǎo)致丙酮?；男纬?，該反應(yīng)也稱(chēng)為N到O的酰基轉(zhuǎn)移，而PanD的催化作用就取決于G24和S25殘基之間的裂解所形成的丙酮酰基。這一過(guò)程產(chǎn)生了一條具有催化活性的α鏈(11 kDa)和一條β鏈(2.8 kDa)。進(jìn)一步研究顯示，大腸桿菌中的PanD蛋白主要以非活性π蛋白形式存在，這可能是由于大腸桿菌中π蛋白的激活需要激活劑PanZ的存在，PanZ-AcCoA 通過(guò)反應(yīng)構(gòu)象的選擇來(lái)促進(jìn)PanD自剪切活化，而PanZ含量的不足將直接影響PanD蛋白裂解的不足，進(jìn)而影響其催化效果[32]。

但是，有研究者發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的PanD的自剪切活性有顯著差異，其中C.glutamicum和B.Subtilis的PanD蛋白幾乎完全裂解。研究者進(jìn)一步通過(guò)定點(diǎn)突變方法對(duì)PanD的自我加工進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體Val23Glu、Ile26Cys、Thr27Ala和Glu56Ser與炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)野生型(96.4%)相比，自剪切效率分別降低至90.5%，83.6%、74.4%和81.2%，即Val23Glu、Ile26Cys、Thr27Ala和Glu56Ser這4個(gè)位點(diǎn)的殘基對(duì)于PanD的自切割過(guò)程至關(guān)重要[33]。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究，通過(guò)對(duì)panD基因家族的分子進(jìn)化和自然選擇壓力分析，結(jié)果檢測(cè)到9個(gè)位點(diǎn)受到顯著的正選擇(A13、T14、V23、L32、V44、N49、L55、L78、L85)。進(jìn)一步通過(guò)定向進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)，其中T14K、V44I和L85V位點(diǎn)的變化影響了PanDBs自剪切力，而A13V、N49V、L32F、L55F、E23V和L78C等位點(diǎn)突變均未影響其自剪切力(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，T14、V44和L85這3個(gè)位點(diǎn)直接影響PanDBs的自剪切力，進(jìn)而影響β-丙氨酸的產(chǎn)量，而其他位點(diǎn)僅僅影響了酶活性。這一項(xiàng)研究對(duì)于后續(xù)PanD蛋白的工程改造具有重要的意義。

1.2.2.2 PanD的分子改造與催化效率

除了自剪切位點(diǎn)外，PanD的分子改造也取得了很多進(jìn)展。比如：通過(guò)不同來(lái)源的PanD的序列比對(duì)結(jié)果顯示，嚴(yán)格保守的位點(diǎn)有17個(gè)，位于活性中心附近的有11個(gè)(Lys9、His11、Tyr22、Gly24、Ser25、Arg54、Thr58、Gly72、Ala73、Ala74和Ile85)[32]，位點(diǎn)均為活性中心附近的保守或半保守位點(diǎn)，對(duì)PanD的自剪切和催化功能起著關(guān)鍵作用。PEI等[34]通過(guò)表征來(lái)自大腸桿菌(PanDEc)，谷氨酸棒桿菌(PanDCg)和枯草芽孢桿菌(PanDBs)的3種PanD，通過(guò)它們的特性，包括比活度，熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在酶活性方面PanDEc<pandCg<pandBs，且PanDBs比另外2種酶具有更高的比活度和熱穩(wěn)定性。在此背景下，ZHANG等[22]提出了一種基于酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的更合理的設(shè)計(jì)，對(duì)B.subtilis來(lái)源的PanD的氨基酸殘基E56定點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸，最終酶活性提高了40%。MO等[35]通過(guò)飽和突變來(lái)自C.jeikeium的PanD，最終獲得4個(gè)有益突變體，A74G和R3K突變體催化穩(wěn)定性分別提高了22.6%和66.4%。另一方面，對(duì)來(lái)源于T.castaneum的PanD通過(guò)基因工程構(gòu)建突變文庫(kù)，最終獲得2個(gè)酶活性明顯提高的突變菌株：16-H5和18-G6；之后通過(guò)輔酶添加量、溫度、pH以及金屬離子等因素進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究，最終267 g/L的底物L-天冬氨酸可生成170.53 g/L的β-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.45%[36]。

盡管生物酶催化合成β-丙氨酸已經(jīng)取得了很多的進(jìn)展，但是考慮到生物催化底物，催化酶在價(jià)格和反應(yīng)條件等的限制，更綠色、有效的微生物發(fā)酵法被進(jìn)一步探究。

1.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用代謝工程、合成生物學(xué)、蛋白工程等手段改造物質(zhì)合成的代謝流，理性對(duì)代謝途徑進(jìn)行修改和設(shè)計(jì)，使目標(biāo)產(chǎn)物大量積累的方法。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，底物便宜且來(lái)源廣泛(如甘油、半乳糖、葡萄糖)，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)巨大的商業(yè)化效益。相較于化學(xué)合成法和酶法合成β-丙氨酸，微生物發(fā)酵法具備反應(yīng)條件相對(duì)溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。其中最常用的β-丙氨酸生產(chǎn)菌株為E.coil[13]和C.glutamicum[37]。

1.3.1 β-丙氨酸的合成途徑

β-丙氨酸的微生物發(fā)酵法主要依賴(lài)于生物體內(nèi)β-丙氨酸的合成途徑，具體過(guò)程如下：首先，微生物通過(guò)半乳糖轉(zhuǎn)移酶(galactose symporter，Galp)將葡萄糖從體外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)葡萄糖激酶形成葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G-6-P)，后續(xù)生成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)；PEP一方面被磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC)催化形成草酰乙酸(oxaloacetate, OAA)，后者被天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AspC)催化成L-天冬氨酸(L-Asp)；另一方面生成丙酮酸(pyruvate，PYR)，在丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，Pyc)的作用下生成OAA，在丙酮酸氧化酶(pyruvic oxidase，PoxB)，丙酮酸甲酸裂解酶(lactate dehydrogenase，PflB)和NAD依賴(lài)型發(fā)酵型D-乳酸脫氫酶(pyruvate formate-lyase，LdhA)催化下分別生成：乙酰輔酶A、乙酸和乳酸，乙酰輔酶A進(jìn)一步在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，AdhE)的作用下生成乙醇。OAA進(jìn)入三羧酸循環(huán)后，中間產(chǎn)物延胡索酸可以在天冬氨酸裂解酶(aspartate lyase，AspA)的催化下胺化生成L-天冬氨酸，之后，L-天冬氨酸在天冬氨酸-α-脫羧酶(Aspartate-α-decarboxylase，PanD)的作用下生成β-丙氨酸。在E.coli中，碳源主要通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(the phosphotransferase system，PTS)運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)，但其中1/2的PEP用于葡萄糖胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及葡萄糖的磷酸化，PTS系統(tǒng)的活性降低是提高PEP前體物質(zhì)的重要策略[38]。具體合成途徑如圖3所示。

圖3 β-丙氨酸生物合成相關(guān)代謝途徑
Fig.3 β-Alanine biosynthesis metabolic pathways

1.3.2 β-丙氨酸微生物發(fā)酵法合成

β-丙氨酸微生物發(fā)酵法主要集中在大腸桿菌中。SONG等[10]利用可生產(chǎn)延胡索酸的大腸桿菌為宿主，通過(guò)aspA、C.glutamicum來(lái)源的panD等基因增加前體物質(zhì)生成，通過(guò)ΔiclR ΔfumC ΔfumA ΔfumB ΔptsG ΔlacI切斷副產(chǎn)物生成，搖瓶發(fā)酵可得3.92 g/L β-丙氨酸。之后，梁珊珊[39]以敲除相關(guān)副產(chǎn)物合成途徑的菌株為基礎(chǔ)菌，疊加敲除天門(mén)冬氨酸激酶(aspartate kinase，LysC)和泛酸合成酶(pantothenate synthase，PanC)和ptsG和aspA基因，過(guò)表達(dá)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)來(lái)源的aspC、C.glutamicum來(lái)源的panD、放線桿菌(Actinobacillus)來(lái)源的pck和乳桿菌(Lactobacillus)來(lái)源的pyc基因，β-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到18.4 g/L。隨后，ZOU等[13]采用增加前體物質(zhì)和切斷副產(chǎn)物的綜合策略，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵獲得了43.12 g/L的β-丙氨酸，為目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-丙氨酸的最高產(chǎn)量，但是該水平還遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化水平。此外，很多研究也在微生物中進(jìn)行理性改造代謝途徑生產(chǎn)β-丙氨酸，具體如表2所示。

表2 β-丙氨酸產(chǎn)生菌構(gòu)建的典型實(shí)例
Table 2 Typical examples of construction of β-alanine producing strains

2 β-丙氨酸代謝工程的調(diào)控機(jī)制

β-丙氨酸生產(chǎn)的代謝工程策略可歸納如下：增加前體物質(zhì)的合成，輔因子ATP、CO2和NADH/NAD+的平衡，減弱競(jìng)爭(zhēng)途徑。

2.1 增加前體物質(zhì)的合成

過(guò)表達(dá)生物合成途徑中關(guān)鍵酶的編碼基因，通常是增加前體物質(zhì)最有效的策略，該策略在代謝工程中的應(yīng)用使β-丙氨酸的產(chǎn)量得到了大幅度提高。

在大腸桿菌β-丙氨酸的合成代謝途徑中，L-天冬氨酸是其直接前體物質(zhì)。當(dāng)增加L-天冬氨酸濃度，PanD與底物的親和力協(xié)同性增大，從而能夠抵消抑制劑的影響，顯著增加β-丙氨酸的產(chǎn)量。L-天冬氨酸是在PPC作用下由草酰乙酸合成，異源過(guò)表達(dá)谷氨酸棒狀桿菌ppc基因顯著提高L-天冬氨酸的生成，進(jìn)而增加β-丙氨酸的產(chǎn)量，達(dá)0.36 g/L[41]。當(dāng)以葡萄糖作為碳源時(shí)，敲除編碼葡萄糖特異性PTS酶(glucose-specific PTS enzyme，PtsG)，PtsG可調(diào)節(jié)菌體碳氮代謝，顯著增強(qiáng)PPC的活性，從而提高了下游產(chǎn)物草酰乙酸的積累量，使β-丙氨酸的產(chǎn)量增加兩倍，達(dá)到1.45 g/L[10]。在敲除PtsG系統(tǒng)的同時(shí)，葡萄糖的攝取途徑可以使用葡萄糖激酶(glucokinase，Glk)進(jìn)行取代，這些改造用于維持氧化還原平衡的PEP，以及通過(guò)消除需要從丙酮酸產(chǎn)生額外的PEP來(lái)提高能源效率，使β-丙氨酸產(chǎn)量提高了1.33 g/L[41]。由于草酰乙酸除了通過(guò)PPC催化磷酸烯醇式丙酮酸羧化而來(lái)，還可以以丙酮酸為底物，通過(guò)丙酮酸羧化酶催化生成。pyc的高水平表達(dá)可以主導(dǎo)CO2固定并可以增加ATP產(chǎn)率(每1分子草酰乙酸產(chǎn)生1個(gè)ATP)。梁姍姍[39]在E.coli中過(guò)表達(dá)Lactobacillus來(lái)源的pyc基因增加丙酮酸到草酰乙酸的代謝流，可使β-丙氨酸產(chǎn)量提高到5.4 mg/L。

在菌株代謝中，L-天冬氨酸合成的另一途徑是延胡索酸在天冬氨酸裂解酶的催化下生成L-天冬氨酸，此反應(yīng)為可逆反應(yīng)，L-天冬氨酸在一定程度上亦可以生成延胡索酸，通過(guò)敲除此途徑，避免L-天冬氨酸外泄，可少量增加β-丙氨酸含量(0.61 g/L)[41]。在隨后的研究中，為了進(jìn)一步增加L-天冬氨酸的生物合成，彌補(bǔ)AspA活性的不足，增強(qiáng)aspA表達(dá)，使TCA循環(huán)的中間代謝物β-丙氨酸產(chǎn)量提高0.51 g/L[13,42]。

2.2 增加拷貝數(shù)及調(diào)節(jié)啟動(dòng)子

除此之外，還可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)酶表達(dá)，以解決β-丙氨酸的生產(chǎn)問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄水平的高低主要取決于啟動(dòng)子的強(qiáng)弱以及啟動(dòng)子與RNA聚合酶的親和力，翻譯水平高低主要取決于RBS序列強(qiáng)弱、RBS序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)和SD序列與ATG之間特異性的序列[43]。粱珊珊[39]采用 PL 啟動(dòng)子溫度調(diào)控兩階段發(fā)酵轉(zhuǎn)換，敲除或過(guò)表達(dá)相關(guān)基因后，發(fā)酵后產(chǎn)量達(dá)到18.4 g/L。SONG等[10]通過(guò)使用合成啟動(dòng)子和RBS序列優(yōu)化ppc的表達(dá)水平，使β-丙氨酸產(chǎn)量增加到3.94 g/L。QIAN[44]則通過(guò)調(diào)節(jié)aspC基因表達(dá)的RBS以及panD基因的拷貝數(shù)，優(yōu)化2種基因在E.coli中的表達(dá)，最終在5 L生物反應(yīng)器中得到了80.4 g/L產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.3%。

本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)panD拷貝數(shù)的變化也是影響β-丙氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。當(dāng)增加EcopanD基因拷貝數(shù)，WpTrc-3ED上清液中β-丙氨酸質(zhì)量濃度(0.56 g/L)顯著高于WpTrc-2ED中(0.21 g/L)，且菌株生長(zhǎng)量在發(fā)酵48 h時(shí)顯著高于WpTrc-2ED菌株生長(zhǎng)量。而對(duì)于BsupanD，WpTrc-BD菌株的β-丙氨酸產(chǎn)量為1.61 g/L，WpTrc-2BD菌株的β-丙氨酸合成量達(dá)到1.68 g/L，而WpTrc-3BD菌株中β-丙氨酸合成量為2.10 g/L，顯著高于WpTrc-2BD菌株的β-丙氨酸濃度。因此，通過(guò)增加panD基因拷貝數(shù)可以顯著提高β-丙氨酸的產(chǎn)量。

2.3 輔因子ATP、CO2和NADH/NAD+的平衡

NADPH是代謝網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵輔因子之一，在氨基酸產(chǎn)生株的生化反應(yīng)和生理功能中起著重要作用。對(duì)NADPH的可用性和形式的操作是在工業(yè)菌株中將碳通量轉(zhuǎn)向氨基酸生物合成的一種有效和簡(jiǎn)單的方法[45]。從葡萄糖合成β-丙氨酸的代謝過(guò)程中伴隨著NAD+/NADH的相互轉(zhuǎn)化，葡萄糖進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)過(guò)糖酵解途徑中3-磷酸甘油醛生成NADH，接著丙酮酸合成乙酰輔酶A過(guò)程也釋放NADH，后續(xù)草酰乙酸合成L-天冬氨酸過(guò)程中則需要消耗NADH。過(guò)表達(dá)碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(BT)和碳酸酐酶基因(CA)增強(qiáng)CO2/碳酸氫鹽同化的同時(shí)，引入一個(gè)輔因子自給系統(tǒng)-天冬氨酸脫氫酶(aaspartate dehydrogenase，AspDH)，該系統(tǒng)可以分別同時(shí)再生NAD+和L-谷氨酸用于糖酵解和AspC，更有效地驅(qū)動(dòng)L-天冬氨酸生成反應(yīng)，將β-丙氨酸產(chǎn)量提高到3.54 g/L[39]。敲除ldhA基因以平衡NADH輔酶代謝的不平衡，可以有效提高β-丙氨酸產(chǎn)量至2.37 g/L[40]。同時(shí)在異源過(guò)表達(dá)pyc基因時(shí)，期間會(huì)消耗1分子CO2，而由L-天冬氨酸通過(guò)PanD合成β-丙氨酸途徑時(shí)產(chǎn)生1分子CO2，因此，增加pyc基因的表達(dá)將有助于CO2的平衡。

2.4 減弱競(jìng)爭(zhēng)途徑

在整個(gè)細(xì)胞的代謝工程中，通過(guò)敲除對(duì)競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑關(guān)鍵的基因，將碳通量重新分配到目標(biāo)產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于代謝重新設(shè)計(jì)策略。大腸桿菌的基因敲除方法主要是通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)，將競(jìng)爭(zhēng)途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或是弱化，此策略已經(jīng)成功應(yīng)用于生產(chǎn)各種氨基酸的生產(chǎn)菌株，可成功減少副產(chǎn)物的生成。

大腸桿菌的ldhA、poxB和pflB編碼的酶共同競(jìng)爭(zhēng)底物丙酮酸，使代謝通路流向乳酸、甲酸、乙醇等副產(chǎn)物。在野生型大腸桿菌B0016[40]中刪除醋酸鹽、甲酸鹽、乙醇和乳酸鹽的副產(chǎn)品路線，可使L-天冬氨酸產(chǎn)量增加，進(jìn)而增加目標(biāo)產(chǎn)物。除此之外，大腸桿菌LysC和AspA的共同底物為L-天冬氨酸，使途徑流向L-賴(lài)氨酸和L-甲硫氨酸等副產(chǎn)物。ZOU等[13]淘汰了3個(gè)原生的天冬氨酸激酶基因，通過(guò)防止天冬氨酸旁路的丟失，促進(jìn)β-丙氨酸的產(chǎn)量提高了1.67 g/L。此外，敲除panC基因并適當(dāng)添加泛酸也是一種增加β-丙氨酸濃度的策略。另一個(gè)典型案例是梁珊珊[39]構(gòu)建的重組大腸桿菌菌株B0016-092B (ackA-pta pflB adhE frdA ldhA lysC panC aspA ptsG)經(jīng)厭氧搖瓶發(fā)酵，使β-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到0.9 mg/L。

3 前景與展望

β-丙氨酸在各個(gè)領(lǐng)域均被廣泛應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。在國(guó)內(nèi)，各大廠商合成β-丙氨酸的方法主要為化學(xué)合成法，但其污染嚴(yán)重且成本較高，不符合綠色、可持續(xù)發(fā)展的要求。近年來(lái)，隨著微生物發(fā)酵工程的不斷發(fā)展，研究者逐漸將目光放在使用基因工程菌生產(chǎn)的β-丙氨酸的研究上，但是目前的研究進(jìn)展還不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的水平?；蚬こ叹笑?丙氨酸合成途徑的相關(guān)調(diào)控多數(shù)已被解析。但是在前體物質(zhì)合成和輔因子NADPH和ATP的提供等方面需進(jìn)一步探究。

隨著基因編輯等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及系統(tǒng)生物學(xué)，合成生物學(xué)的多種平臺(tái)的利用，將不同生物中的優(yōu)勢(shì)途徑進(jìn)行改造和組合是β-丙氨酸產(chǎn)量提高的一個(gè)關(guān)鍵。對(duì)于β-丙氨酸的優(yōu)勢(shì)途徑主要有：前體物質(zhì)的增加、輔因子的平衡和副產(chǎn)物的減少，單獨(dú)采取優(yōu)勢(shì)途徑或是對(duì)優(yōu)勢(shì)途徑進(jìn)行整合改造均可提高β-丙氨酸的產(chǎn)量。ZOU等[13]采用前體物質(zhì)和副產(chǎn)物的綜合策略，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵獲得了43.12 g/L的β-丙氨酸。PIAO等[41]采取3個(gè)優(yōu)勢(shì)途徑均進(jìn)行優(yōu)化改造的方式，過(guò)表達(dá)ppc、glk、aspC和panD基因，敲除posB、ldhA、pflB和aspA等副產(chǎn)物生成基因，將前體物質(zhì)的碳通量最大限度的轉(zhuǎn)移到β-丙氨酸代謝途徑，同時(shí)過(guò)表達(dá)BT和CA增強(qiáng)CO2/碳酸氫鹽同化，增加輔因子自給自足系統(tǒng)，構(gòu)建菌株將β-丙氨酸質(zhì)量濃度提高到37.7 g/L。其中，PanD作為關(guān)鍵酶，已做了廣泛的研究。PanD需要自剪切才能完成激活，其中V23，I26，T27和E56這4個(gè)位點(diǎn)的殘基對(duì)于PanD的自切割過(guò)程尤其重要[33]，且來(lái)自枯草芽孢桿菌(PanDBs)的酶具有更高的比活度和熱穩(wěn)定性[34]，經(jīng)過(guò)后續(xù)研究，已獲得各種突變體提高其酶活力和穩(wěn)定性，為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。

目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-丙氨酸的產(chǎn)量仍然處于較低水平，在后續(xù)的相關(guān)研究中，可以采取以下策略增加β-丙氨酸產(chǎn)量：(1)調(diào)節(jié)3個(gè)輔因子NADH、ATP以及CO2的相互平衡，使更多的碳通量流向β-丙氨酸生物合成，從而增加β-丙氨酸的產(chǎn)量。(2)持續(xù)增加前體物質(zhì)的合成和副產(chǎn)物途徑的阻斷。(3)采取并優(yōu)化兩階段發(fā)酵方法，有氧生長(zhǎng)和厭氧生長(zhǎng)協(xié)同作用，提高β-丙氨酸產(chǎn)量。(4)自動(dòng)化算法。通過(guò)以上幾個(gè)方面的改良有希望將微生物工程改造到更高效的平臺(tái)以生產(chǎn)β-丙氨酸。