苯酚及其衍生物是制漿造紙[1]、紡織加工、煤氣化、石油精煉等工業(yè)廢水中常見的主要有機(jī)污染物。其中造紙廢水生化出水中含有27種有機(jī)污染物，包括2,4-二叔丁基苯酚、2,2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、雙酚A、2,4,6-三氯苯酚等苯酚類特征污染物[2]。而單體苯酚是苯酚類污染物最簡單的中間體，單體苯酚由于其難降解性和普遍存在性，常被認(rèn)定為具有酚類代表性的難降解化學(xué)污染物[3-4]。在各種去除苯酚的方法中，生物降解法具有成本低、無二次污染、可循環(huán)使用等優(yōu)點(diǎn)，在含酚廢水處理中具有良好的應(yīng)用前景[5]。
然而，用于生物降解的游離微生物在細(xì)胞生長和細(xì)胞分離再利用過程中，容易受到環(huán)境因素（如培養(yǎng)液pH值和污染物濃度）敏感性的限制[6]。對(duì)游離細(xì)菌進(jìn)行固定化處理可增強(qiáng)微生物抵抗極端環(huán)境毒性的能力，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)微生物的快速高效分離。許多有機(jī)材料和無機(jī)材料都可以作為細(xì)菌固定化基質(zhì)。瓊脂作為一種天然高分子聚合物，由于其膠凝能力強(qiáng)、耐酸，有較高的生物相容性，常被用作有機(jī)固定化基質(zhì)，因此許多研究中使用瓊脂來固定微生物和酶[7]。海藻酸鈉在溫和條件下可與鈣離子交聯(lián)，和游離細(xì)菌具有較高的相容性，是一種廣泛使用的無毒固定細(xì)菌材料[8]。近年來，蒙脫土、高嶺土等黏土礦物作為生物成分的載體和固定基質(zhì)，因其對(duì)細(xì)胞無毒害作用和親水性而備受關(guān)注[9]。Fang等人[10]用瓊脂卡拉膠復(fù)合納米Fe3O4固定化細(xì)菌，研究了材料對(duì)細(xì)菌的吸附性能和各因素的影響程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化后可明顯提高降酚速率，且能實(shí)現(xiàn)高達(dá)50次的循環(huán)利用率。Mandal等人[11]研究發(fā)現(xiàn)膨潤土固定化的分枝桿菌 VF1 對(duì)酚降解速率有明顯提高，黏土復(fù)合材料可以減緩環(huán)境對(duì)細(xì)菌的毒性，從而為細(xì)菌的生存創(chuàng)造一個(gè)合適的微環(huán)境。
本研究利用蒙脫土作為有機(jī)復(fù)合固定化材料海藻酸鈉-瓊脂凝膠的支持基質(zhì)，制備海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化微球。研究優(yōu)化了固定化微球的最佳耦合條件和不同苯酚初始濃度下細(xì)菌的降解規(guī)律和降解動(dòng)力學(xué)模型，以確定苯酚降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)；探究了極端pH條件下固定化微球的苯酚降解效果和固定化微球的循環(huán)利用性能及存儲(chǔ)穩(wěn)定性。
1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、培養(yǎng)條件和試劑
實(shí)驗(yàn)使用的苯酚降解菌株為革蘭氏陰性短粗桿菌Klebsiella pneumoniae ZS01，來自于本實(shí)驗(yàn)室（-80℃超低溫冷凍儲(chǔ)存冰箱）。
（1）菌株在pH值為7的MPYE培養(yǎng)基中進(jìn)行富集，每升培養(yǎng)基中含有3 g魚粉蛋白胨，3 g酵母膏，1 g CaCl2·2H2O，1.6 g MgCl2，在恒溫?fù)u床中以150 r/min的轉(zhuǎn)速在35℃下進(jìn)行培養(yǎng)。菌株生長24 h后，在4℃下以 8000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min去除上清液來收集細(xì)菌。用無菌水通過紫外可見分光光度計(jì)在600 nm下將細(xì)菌濃度調(diào)整到0.8，用于細(xì)菌固定化。
（2）在苯酚降解過程中，富集菌株在35℃的MedA培養(yǎng)基中生長，每升培養(yǎng)基中含有：2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%天冬氨酸、20 mL pH值為6.8的Solution C溶液（10 g氮川三乙酸，3.33 g CaCl2，29.5 g MgSO4·7H2O，93 mg (NH4)6Mo7O24·4H2O，99 mg FeSO4·7H2O，50 mL微量元素溶液）、1.25 g L-谷氨酸、10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaCl。培養(yǎng)基用1 mol /L KOH和1 mol /L HCl溶液將其pH值調(diào)至7.0~7.3后120℃高溫滅菌30 min，然后用微孔濾膜加入10 mL維生素溶液、20 mL磷酸鹽緩沖溶液（將KH2PO4溶液加入到K2HPO4溶液中至pH值為6.8）。
（3）苯酚原液的配制：取一定量的苯酚將其配制成6 g/100 mL的苯酚原液并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>
蒙脫土（240 m2/g）、海藻酸鈉、瓊脂和苯酚試劑均購自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他化學(xué)品均為分析純或色譜純；所有培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)材料均預(yù)先在120℃下高壓滅菌。
立式蒸汽壓力滅菌鍋，型號(hào)SN510C，重慶雅瑪拓科技有限公司；生物安全柜，型號(hào)AC2-4S1，新加坡ESCO科技有限公司；雙層恒溫?fù)u床，型號(hào)QYC-210C，江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；離心機(jī)，型號(hào)3k15，上海斯信生物科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)UV759，上海佑科儀器儀表有限公司；環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM），型號(hào)S4800，日本理學(xué)。
將蒙脫土和瓊脂溶解在去離子水中，混合分散加熱至100℃后，加入海藻酸鈉，不斷加熱攪拌30 min，至水凝膠混合均勻，并且確保水凝膠不含氣泡。混合均勻的水凝膠溶液在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌30 min，將富集菌株加入至滅菌后冷卻的水凝膠溶液（約40℃）中并充分混合均勻。通過注射器將均質(zhì)水凝膠溶液滴入滅菌的CaCl2（4% 質(zhì)量/體積）中，制備直徑約3 mm、質(zhì)量約50 mg的水凝膠珠，于4℃冰箱中固定化12 h。固定的水凝膠珠用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=7.2）至少洗滌3次以去除微球上殘留的鈣離子，制得海藻酸鈉-蒙脫土-瓊脂固定化微球。制備的固定化微球儲(chǔ)存在4℃中以備后用。
為更好地研究固定化微球的降解效果，首先探究了影響固定化微球生物降解苯酚性能的4個(gè)因素。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)不同影響因素采用一定遞增比例的濃度進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。將不同濃度的固定化微球和滅菌苯酚加入裝有100 mL滅菌MedA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，使苯酚濃度達(dá)到1000 mg/L。將所有燒瓶用滅菌封口膜密封以防止苯酚氧化，然后置于35℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中降解。定期收集樣品，并測量殘留苯酚濃度。
在上述最佳條件下，還研究了固定化微球在苯酚作為唯一碳源時(shí)，苯酚降解性能最優(yōu)時(shí)的苯酚初始濃度。在不同苯酚初始濃度（200、400、600、800、1000 mg/L）條件下，接種相同濃度的游離細(xì)菌作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，將它們與固定化微球的降酚性能進(jìn)行比較。定期收集樣品測量苯酚的殘留濃度。苯酚降解數(shù)據(jù)用于計(jì)算苯酚降解的比降解速率和降解動(dòng)力學(xué)分析。
殘留苯酚濃度采用 4-氨基安替比林法測定[12]。采用比濁法對(duì)培養(yǎng)液中的生物量進(jìn)行測定（OD600）。
一階動(dòng)力學(xué)通常用于描述不同污染物的生物降解?；?.4研究結(jié)果，使用偽一級(jí)模型評(píng)估苯酚降解過程的降解動(dòng)力學(xué)。一階動(dòng)力學(xué)速率方程見式(1)和式(2)。
式中，St為t時(shí)刻苯酚濃度，mg/L，S0為苯酚初始濃度，mg/L，μ為比降解速率，h-1。生物降解率（dS/dt）由生物量指數(shù)生長階段苯酚濃度隨時(shí)間的斜率決定。
Haldane模型[13]被擬合到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，以表示本研究中游離細(xì)菌和固定化微球?qū)Ρ椒拥慕到鈩?dòng)力學(xué)，見式(3)。
式中，μmax為最大比降解速率，h-1，S0為苯酚初始濃度，mg/L，Ks為底物親和常數(shù)，mg/L，Ki為底物抑制常數(shù)，mg/L。Ki值較大表示微生物對(duì)底物抑制的敏感性較低。通過使用非線性回歸[14]計(jì)算相應(yīng)的苯酚初始濃度和μ，獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)和擬合曲線。
將固定化微球加入到含有1000 mg/L 苯酚的100 mL MedA培養(yǎng)基中，每次循環(huán)時(shí)間一直持續(xù)到苯酚降解完成。每次生物降解過程結(jié)束后，棄去之前的培養(yǎng)基，用無菌水徹底清洗固定化微球3次，然后將其轉(zhuǎn)移到含有1000 mg/L苯酚的100 mL MedA新鮮培養(yǎng)基中，進(jìn)行循環(huán)降解實(shí)驗(yàn)。
為了評(píng)估固定化微球的貯存穩(wěn)定性，將固定化微球和含有相同濃度的游離細(xì)菌同時(shí)在4℃的冰箱中儲(chǔ)存5~30天，然后在苯酚濃度為1000 mg/L進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。
2.1 游離細(xì)菌和固定化微球的表面形態(tài)及ESEM形貌特征
圖1(a)為海藻酸鈉微球的表面直觀圖，由圖1(a)可以看出，海藻酸鈉具有很好的成球性，呈透明白色狀。圖1(b)為固定化微球的表面直觀圖，復(fù)合瓊脂和蒙脫土后，微球變?yōu)椴煌该魅榘咨?，形狀?guī)則，球體大小均勻。圖1(c)為固定化微球重復(fù)使用5次后的外觀圖，經(jīng)5次循環(huán)后，微球外觀已變成黃色，這是因?yàn)槲⑶騼?nèi)部繁殖生長出大量的細(xì)菌細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌為黃色，因此固定化微球也變成黃色。
Fig. 1 Appearance of different materials
圖2(a)~圖2(d)為游離細(xì)菌、不同固定材料及固定化微球的橫截面形貌圖。由圖2(a)可以看出，海藻酸鈉微球內(nèi)部包含不規(guī)則的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)類似于先前研究得出的結(jié)論[15]。由圖2(b)可以看出，此時(shí)海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土微球內(nèi)部變成了更為緊湊的片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)?？梢姯傊兔擅撏僚c海藻酸鈉交聯(lián)后，微球內(nèi)部孔隙增多，一方面為細(xì)菌的附著和固定提供了更大的比表面積，另一方面也增加了底物的傳質(zhì)效率，也有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和新陳代謝產(chǎn)物的排出。對(duì)比游離細(xì)菌（圖2(c)）的形貌圖，說明固定化微球（圖2(d)）內(nèi)部有大量細(xì)菌成功附著。
Fig. 2 ESEM images of different immobilized materials and immobilized microphere
2.2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)
本研究將海藻酸鈉滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% CaCl2溶液中形成凝膠微球，研究了不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解的影響。圖3(a)為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解速率的影響。由圖3(a)可知，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的固定化微球苯酚達(dá)到最大降解速率（18.18 mg/（L·h））。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增多，固定化微球內(nèi)部比表面積增大，為微生物提供了足夠的吸附、生長、繁殖的空間，從而提高了微生物傳質(zhì)效率。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至1.5%時(shí)，導(dǎo)致固定化微球的苯酚降解速率下降（15.87 mg/（L·h）），說明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻酸鈉會(huì)使固定化微球內(nèi)部過飽和，阻礙底物分子通過微球內(nèi)部擴(kuò)散，降低細(xì)菌對(duì)苯酚的降解速率[16]。綜上，制備固定化微球海藻酸鈉的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。
Fig. 3 Factors affecting the degradation rate of phenol
2.2.2 蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)
不同蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解的影響結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知，當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0增加到1.0%時(shí)，苯酚降解速率緩慢增加。當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，苯酚降解速率達(dá)最大值17.85 mg/（L·h）。這是因?yàn)槊擅撏量梢晕丈倭勘椒?，減輕苯酚對(duì)細(xì)胞的毒性，為細(xì)菌生存創(chuàng)造良好的微環(huán)境。在固定化微球中加入蒙脫土可以提高其機(jī)械強(qiáng)度、滲透性[15]。但當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至2.0%時(shí)，苯酚降解速率與低質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒙脫土苯酚降解速率相當(dāng)，約（16 mg/（L·h）），這可能是由于固定化微球中高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蒙脫土堵塞了微球的內(nèi)部孔隙，阻礙了細(xì)菌的生長和底物的擴(kuò)散，從而抑制了降解細(xì)菌的活性。綜合考慮，固定化微球中蒙脫土的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。
2.2.3 瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)
瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化微球降解苯酚性能的影響如圖3(c)所示。由于瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高（0.5%、1.0%），固定化微球的片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增加，固定化微球內(nèi)部平均孔徑增加，機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性也隨之增加，固定化細(xì)菌的數(shù)量也隨之增加，細(xì)菌降解苯酚的速率進(jìn)一步提高，這一結(jié)果在Rehman等人[17]的研究中也有體現(xiàn)。當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)（2.0%），固定化微球內(nèi)部變得更為致密，導(dǎo)致內(nèi)部孔徑減小，也影響了底物擴(kuò)散到固定化微球內(nèi)部的速度，從而降低了苯酚的降解效率。因此，制備固定化微球的最佳瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。
不同包埋細(xì)菌濃度（體積分?jǐn)?shù)10%~30%）(OD600為0.8)對(duì)苯酚降解速率的影響結(jié)果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知，隨著細(xì)菌接種量的增加，苯酚的降解速率逐漸增加。細(xì)菌接種量從20%增加至25%時(shí)，苯酚降解速率迅速增加到18 mg/（L·h），這是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞對(duì)高濃度苯酚的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞增殖更快，生物降解效率更高。當(dāng)接種量升高至30%時(shí)，降解速率并未顯著提高，大量細(xì)菌在微球內(nèi)部迅速繁殖導(dǎo)致微球過飽和，此時(shí)不僅影響微球的機(jī)械穩(wěn)定性，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌從微球泄露到溶液中，影響后續(xù)循環(huán)降解實(shí)驗(yàn)[18]。綜合上述因素，制備固定化微球的最佳細(xì)菌接種量為25%。
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)考察影響固定化微球各因素之間的交互作用，從而確定最優(yōu)的細(xì)菌固定化條件，正交因素水平如表1所示。
表1 固定化微球降解苯酚正交實(shí)驗(yàn)因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment on degradation rate of phenol by immobilized microspheres
| 因素 | 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)/% | 蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)/% | 瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)/% | 細(xì)菌接種量(D)/% |
|---|
| 1 | 0.9 | 1.3 | 0.9 | 23 |
| 2 | 1.0 | 1.5 | 1.0 | 25 |
| 3 | 1.1 | 1.7 | 1.1 | 27 |
Ki值表示該列因素水平為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總和，可以判斷某個(gè)因素的最優(yōu)水平和最優(yōu)組合；R值表示某個(gè)因素水平的極差，反應(yīng)某個(gè)因素水平波動(dòng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變動(dòng)幅度，R值越大，該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大，可以判斷因素的主次順序。以固定化微球?qū)Ρ椒拥慕到馑俾蕿榭疾熘笜?biāo)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，影響固定化微球?qū)Ρ椒咏到馑俾室蛩氐闹鞔雾樞驗(yàn)椋汉Ｔ逅徕c質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞細(xì)菌接種量＞瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)。正交實(shí)驗(yàn)得出制備固定化微球的最優(yōu)組合為：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，細(xì)菌接種量25%。在最優(yōu)固定化條件下制備固定化微球，固定化微球可在60 h內(nèi)完全降解1000 mg/L的苯酚，苯酚降解速率為16.67 mg/(L·h)。
表2 固定化微球降解苯酚正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Table 2 Orthogonal test results and analysis of degradation rate of phenol by immobilized microspheres
| 編號(hào) | A/% | B/% | C/% | D/% | 苯酚降解速率/mg·(L·h)-1 |
|---|
| 1 | 0.9 | 1.3 | 0.9 | 23 | 15.15 |
| 2 | 0.9 | 1.7 | 1.1 | 27 | 15.38 |
| 3 | 0.9 | 1.5 | 1.0 | 25 | 16.39 |
| 4 | 1.0 | 1.7 | 1.1 | 25 | 16.54 |
| 5 | 1.0 | 1.3 | 1.0 | 23 | 15.63 |
| 6 | 1.0 | 1.5 | 0.9 | 27 | 16.13 |
| 7 | 1.1 | 1.5 | 1.0 | 27 | 16.26 |
| 8 | 1.1 | 1.3 | 1.1 | 25 | 15.74 |
| 9 | 1.1 | 1.7 | 0.9 | 23 | 15.58 |
| K1 | 46.92 | 46.52 | 46.86 | 46.36 |
|
| K2 | 48.40 | 47.78 | 48.28 | 47.80 |
|
| K3 | 47.58 | 47.50 | 47.66 | 47.77 |
|
| R | 1.48 | 1.26 | 1.42 | 1.44 |
|
在最優(yōu)海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化條件下制備固定化微球后，固定化微球在不同苯酚初始濃度下的苯酚降解過程如圖4所示。由圖4可知，固定化微球在60 h內(nèi)對(duì)不同初始濃度下的苯酚可以全部有效降解，而游離細(xì)菌降解完成則需要72 h（降解速率為13.89 mg/（L·h））。首先，固定化微球?qū)Ρ椒佑幸欢ǖ奈阶饔?，所以固定化微球在? h，苯酚濃度均有明顯下降。不同的是在低苯酚初始濃度（0~400 mg/L）的條件下，苯酚濃度的降低實(shí)際上與時(shí)間呈線性關(guān)系，因此，在線性范圍內(nèi)對(duì)于給定的苯酚初始濃度，降解速率是恒定的。但在高濃度條件下（400~1000 mg/L），固定化微球的降解存在一定的滯后期（大概12 h左右），這是由于高濃度苯酚對(duì)細(xì)菌降解的抑制作用，因此苯酚濃度隨時(shí)間的下降呈非線性。游離細(xì)菌的降解規(guī)律與固定化微球有很大的相似性，但不同的是游離細(xì)菌有長達(dá)24 h滯后期。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固定化處理在一定程度上可以降低高濃度苯酚直接接觸對(duì)細(xì)菌降解產(chǎn)生的抑制作用，因此固定化后明顯降低了細(xì)菌降解苯酚的遲滯期。
圖4 苯酚初始濃度對(duì)固定化微球和游離細(xì)菌降解苯酚的影響
Fig. 4 Effect of the initial concentration of phenol on the degradation of phenol by immobilized micropheres and free bacteria
在指數(shù)生長階段測定了200~1000 mg /L苯酚初始濃度的一級(jí)生物降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3所示。由表3可知，隨著苯酚初始濃度的增加，固定化微球在400 mg/L時(shí)比降解速率達(dá)到最大值。
表3 游離細(xì)菌和固定化微球?qū)Ρ椒拥囊患?jí)降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)
Table 3 Parameters of first-order biodegradation kinetics of phenol by free bacteria and immobilized micropheres
| 苯酚初始濃度/mg·L-1 | 游離細(xì)菌 | 固定化微球 |
|---|
| 一階反應(yīng)模型(-μ) | μ | R2 | 一階反應(yīng)模型(-μ) | μ | R2 |
|---|
| 200 | ln (St /S0) = -0.072 | 0.072 | 0.985 | ln (St /S0) =-0.104 | 0.104 | 0.978 |
| 400 | ln (St /S0) = -0.074 | 0.074 | 0.976 | ln (St /S0) =-0.126 | 0.126 | 0.987 |
| 600 | ln (St /S0) = -0.062 | 0.062 | 0.973 | ln (St /S0) =-0.093 | 0.093 | 0.982 |
| 800 | ln (St /S0) = -0.044 | 0.044 | 0.980 | ln (St /S0) =-0.079 | 0.079 | 0.976 |
| 1000 | ln (St /S0) = -0.037 | 0.037 | 0.975 | ln (St /S0) =-0.065 | 0.065 | 0.969 |
將上述比降解速率與其對(duì)應(yīng)的苯酚初始濃度通過非線性曲線擬合，確定游離細(xì)菌和固定化微球的比生長率擬合曲線圖以及模型預(yù)測的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見圖5。由圖5可知，游離細(xì)菌（R2=0.944）和固定化微球（R2=0.953）的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型預(yù)測均具有較高的相關(guān)系數(shù)。數(shù)據(jù)擬合Haldane模型得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)值表明固定化微球獲得的預(yù)測μmax值（0.257 h-1）顯著高于游離細(xì)菌μmax（0.198 h-1），表明固定化微球具有更高的苯酚降解性能。游離細(xì)菌苯酚比降解速率在苯酚初始濃度約100~200 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，而固定化微球的比降解速率在苯酚初始濃度200~300 mg/L時(shí)達(dá)到最高；苯酚的進(jìn)一步增加導(dǎo)致μ的減少，表明高濃度苯酚對(duì)生物降解能力有相當(dāng)大的抑制作用。固定化微球可以耐受高濃度的苯酚，在1000 mg/L時(shí)固定化微球μ約為0.07 h-1，而游離細(xì)菌μ為0.04 h-1。模型參數(shù)顯示固定化微球的底物抑制常數(shù)Ki（402.5）大于游離細(xì)菌Ki（233.1），說明固定化微球?qū)Ρ椒右种频拿舾行缘陀谟坞x細(xì)菌。這是因?yàn)楣潭ɑ⑶騼?nèi)部由有機(jī)-無機(jī)耦合形成的交叉網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以作為苯酚對(duì)細(xì)胞毒性的有益物理屏障，從而降低底物對(duì)細(xì)菌抑制作用的敏感性，增強(qiáng)細(xì)菌在高苯酚初始濃度下的降酚能力[19]。
圖5 游離細(xì)菌和固定化微球比生長率擬合曲線
Fig. 5 Fitting curve of specific growth rate of free bacteria and immobilized micropheres
2.5 苯酚在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下降解
培養(yǎng)液的pH值影響細(xì)菌的酶活性，進(jìn)而影響微生物的生長速度，以及降酚菌對(duì)苯酚的降解效率。極端pH環(huán)境下對(duì)固定化微球降解苯酚初始濃度為1000 mg/L的影響見圖6。圖6(a)顯示當(dāng)pH值為1時(shí)，游離細(xì)菌完全不能降解苯酚，這是由于強(qiáng)酸性容易導(dǎo)致酶失活，相同條件下固定化微球則可以完成降解，但降解所需時(shí)間長達(dá)78 h；pH值為3時(shí)固定化微球完成降解時(shí)間也需68 h。以上結(jié)果表明，復(fù)合固定化材料有效地保護(hù)了細(xì)菌的活性。圖6(b)顯示當(dāng)pH值提高到10和12，游離細(xì)菌對(duì)苯酚有一定程度的降解，同時(shí)固定化微球也能在相同條件下保持較高的降解效率（pH值為10和12時(shí)，完成降解時(shí)間分別為60 h和68 h）。固定化微球在pH值為10的降解效率最高，這可能是由于苯酚降解過程中的酸性代謝物與培養(yǎng)基中的堿性化合物發(fā)生中和反應(yīng)，從而自動(dòng)調(diào)整了反應(yīng)系統(tǒng)中的pH[20]。結(jié)果表明，固定化微球作為屏障，可以保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌免受極端環(huán)境的侵害，固定化后細(xì)菌對(duì)酸性和堿性環(huán)境均具有較好的適應(yīng)性。
圖6 極端pH值對(duì)游離細(xì)菌和固定化微球降解苯酚的影響
Fig. 6 Effect of extreme pH on the degradation of phenol by free bacteria and immobilized micropheres
2.6 固定化微球的重復(fù)使用性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性
重復(fù)使用性是固定化微球的一個(gè)重要考察指標(biāo)，循環(huán)周期中固定化微球苯酚降解速率和細(xì)胞活性見圖7。如圖7(a)所示，在前6個(gè)循環(huán)中苯酚降解速率迅速增加，苯酚降解速率從16.67 mg/（L·h）增加到45.45 mg/（L·h），此時(shí)固定化微球降酚效率處于穩(wěn)定期，降解時(shí)間維持在22 h。由圖7(b)可知，設(shè)定初始細(xì)菌活性為100%，相對(duì)活性以其初始活性的百分比表示，循環(huán)周期中固定化微球的相對(duì)活性與苯酚降解速率的趨勢是一致的，重復(fù)培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌分泌大量胞外聚合物，形成了生物膜，為重復(fù)苯酚降解提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境[19]。后期降解效率略微下降，這可能是因?yàn)楣潭ɑ⑶蛑屑?xì)菌生物質(zhì)的最大量，限制了底物轉(zhuǎn)移到微球內(nèi)部中。實(shí)驗(yàn)過程中觀察發(fā)現(xiàn)，珠粒的形態(tài)基本保持完整的形態(tài)，直到32次循環(huán)結(jié)束，珠子結(jié)構(gòu)完全被破壞，循環(huán)終止。
圖7 循環(huán)周期中固定化微球的苯酚降解速率與細(xì)菌活性
Fig. 7 Degradation rate and cell viability of immobilized micropheres in the cycle
固定化微球的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是其是否能被工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用的重要考量因素之一。圖8為固定化微球和游離細(xì)菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。如圖8所示，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，固定化微球保持穩(wěn)定的苯酚降解率，在4℃下儲(chǔ)存30天后依然可以去除99%的苯酚。微球內(nèi)的細(xì)菌保持生理穩(wěn)定性且微球具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。相比之下，游離細(xì)菌的苯酚降解率在超過15天后急劇下降，甚至在30天后失去活性。以上結(jié)果表明固定化微球具有很強(qiáng)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用，在實(shí)際應(yīng)用中具有巨大的潛力。
圖8 固定化微球和游離細(xì)菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性
Fig. 8 Storage stability of immobilized micropheres and free bacteria
本研究制備了海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化微球苯酚降解菌，以苯酚降解速率為考察指標(biāo)，探究了最佳固定化條件及各因素對(duì)苯酚降解速率的影響。
3.1 以海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土凝膠微球?yàn)檩d體制備固定化微球的最佳條件為：1.0% 海藻酸鈉、1.5%蒙脫土、1.0%瓊脂和25%細(xì)菌接種量。與游離細(xì)菌苯酚降解速率（13.89 mg/(L·h)）相比，固定化微球的苯酚降解速率（16.67 mg/(L·h)）顯著提高。
3.2 細(xì)菌的生物降解能力受苯酚初始濃度影響較大。較高的苯酚初始濃度會(huì)抑制生物量，降低生物降解率。固定化微球在60 h內(nèi)對(duì)1000 mg/L的苯酚有較好的降解效果，而在相同條件下游離細(xì)菌降解則需要72 h。Haldane抑制模型顯示，固定化可以顯著降低細(xì)菌對(duì)苯酚抑制的敏感性。
3.3 極端酸堿性條件下，固定化微球的降酚性能體現(xiàn)了顯著的優(yōu)越性，可以承受更廣泛的酸性變化，并在堿性條件下保持較高的降解效率。
3.4 固定化微球可重復(fù)使用32次，在4℃保存30天后，依舊可以去除99%的苯酚。
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