QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定動物源性食品中矮壯素殘留

矮壯素(chlormequat，CCC)是一種季銨鹽類植物生長調(diào)節(jié)劑，分子式為C5H13Cl2 N，可用于小麥、西紅柿、玉米等作物。近年來，矮壯素在谷物、蔬菜水果、飼料中的殘留時有報道，而通過食物鏈富集等方式進入動物體內(nèi)的矮壯素殘留也成為影響動物源性食品安全的潛在因素。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021已規(guī)定動物源性食品中矮壯素殘留的臨時限量值，包括豬肉及內(nèi)臟、牛肉及內(nèi)臟、羊肉及內(nèi)臟、禽肉類及內(nèi)臟、蛋類和生乳，但標(biāo)準(zhǔn)并未指定相應(yīng)的檢測方法。

目前，國內(nèi)外關(guān)于食品中矮壯素的檢測主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-14]，常用的前處理方法有直接萃取法[1-2]、固相萃取(solid-phase extraction,SPE)法[3-6]、QuEChERS法[7-14]等。直接萃取法適用于基質(zhì)較為單一的樣品；SPE法凈化效果好，但存在操作繁瑣、消耗時間長等不足；QuEChERS法具有快速、高效等優(yōu)點，被廣泛運用于果蔬類樣品，但應(yīng)用于動物源性食品中矮壯素檢測的研究很少。本文以動物源性食品為研究對象，采用內(nèi)標(biāo)法定量，優(yōu)化了質(zhì)譜條件、QuEChERS前處理條件等，建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法快速測定動物源性食品中矮壯素殘留的分析方法，并利用該方法分析了市場上流通的動物源性食品。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Vanquish-TSQ Quantis超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Millipore Elix? Essential 3超純水儀，法國默克密理博公司；Auto HG-24 Plus全自動均質(zhì)器，深圳市新銳科技發(fā)展有限公司；ST16高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；GM200刀式研磨儀，德國Retsch公司；電子天平(精度0.1 mg)，德國賽多利斯公司；Venusil MP C18(2)色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)，天津博納艾杰爾科技有限公司。

矮壯素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)、矮壯素-D4標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.3%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)、乙酸(色譜純)、C18吸附劑、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)吸附劑、石墨化碳黑(graphitized carbon black，GCB)吸附劑，上海安譜實驗科技股份有限公司；無水硫酸鎂(分析純)、氯化鈉(分析純)，國藥集團有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量矮壯素-D4標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液，冷藏貯存。取矮壯素-D4內(nèi)標(biāo)儲備液適量，用乙腈稀釋成500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，冷藏貯存，備用。

準(zhǔn)確稱取適量矮壯素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冷藏貯存。取矮壯素標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，加入適量內(nèi)標(biāo)工作液，用V(乙腈)∶V(水溶液)=1∶1配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(含內(nèi)標(biāo)5 μg/L)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.00 g(精確至0.01 g)制備均勻的試樣于50 mL離心管中，加入5 mL水，準(zhǔn)確加入200 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(500 ng/mL)，混勻；加入10 mL乙腈，13 000 r/min 均質(zhì)2 min，加入2 g氯化鈉、2 g無水硫酸鎂，渦旋1 min，7 000 r/min離心5 min；取2 mL上清液加入QuEChERS凈化管(含100 mg無水硫酸鎂、100 mg C18、100 mg PSA)中，渦旋1 min，3 000 r/min離心3 min，取1 mL上清液加入1 mL水，混勻，過0.22 μm 有機濾膜后供UPLC-MS/MS測定。

1.3.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Venusil MP C18(2) 柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：A為乙腈，B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，具體梯度洗脫程序見表1。

表1 矮壯素梯度洗脫程序
Table 1 Gradient elution program of the CCC

電噴霧電離源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測掃描；噴霧電壓：3 500 V；離子傳輸管溫度：325 ℃；蒸發(fā)溫度：300 ℃；鞘氣壓力：40.0 Arb；輔助氣壓力：10.0 Arb；其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 矮壯素和矮壯素-D4的質(zhì)譜參數(shù)
Table 2 MS parameters of the CCC and CCC-D4

注：*表示定量離子

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧電離源正離子模式，通過蠕動泵將質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液以10 μL/min流速分別注入離子源，優(yōu)化母離子、透鏡補償電壓、子離子、碰撞能等參數(shù)。矮壯素和矮壯素-D4在進入一級質(zhì)譜后能產(chǎn)生穩(wěn)定的[M-Cl]離子，由于氯元素在自然界中有35Cl和37Cl兩種同位素，其一級質(zhì)譜圖含2個碎片離子峰(如圖1-a、圖1-b所示)；選取其中豐度高且穩(wěn)定的離子作為母離子進入二級質(zhì)譜，產(chǎn)生的二級離子碎片質(zhì)譜圖如圖1-c、圖1-d所示。

a-矮壯素一級質(zhì)譜圖；b-矮壯素-D4一級質(zhì)譜圖；c-矮壯素二級質(zhì)譜圖；d-矮壯素-D4二級質(zhì)譜圖
圖1 矮壯素和矮壯素-D4離子碎片質(zhì)譜圖
Fig.1 Ion fragment mass spectrum of CCC and CCC-D4

2.2 提取溶劑的選擇

矮壯素是一種強極性農(nóng)藥，常采用乙腈、酸化乙腈等溶劑提取。LI等[9]研究采用乙腈提取肉中的矮壯素，再經(jīng)分散固相萃取法凈化，內(nèi)標(biāo)法定量，方法回收率可以達到86.4%～94.7%；肖泳等[6]研究采用1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸乙腈提取動物源性食品中的矮壯素，再經(jīng)SPE法凈化，內(nèi)標(biāo)法定量，方法回收率可以達到93.4%～101%。本研究選取牛肝、羊肉、雞蛋、奶粉4種陰性樣品作為研究對象，比較了乙腈、1%乙酸乙腈、5%乙酸乙腈作為提取溶劑時的提取效果。結(jié)果顯示，采用這3種溶劑提取樣品中的矮壯素，再經(jīng)QuEChERS法凈化，內(nèi)標(biāo)法定量，方法回收率均能達到80%以上，同位素內(nèi)標(biāo)矮壯素-D4的加入可以修正樣品前處理過程產(chǎn)生的誤差，提高方法的準(zhǔn)確度；試驗發(fā)現(xiàn)，隨著提取溶劑中酸的加入，提取液中色素等干擾物越來越多，不利于后期的凈化。為盡可能提高方法的靈敏度，試驗從基質(zhì)效應(yīng)的角度對提取溶劑作出進一步的選擇。

試驗按照MATUSZEWSKI等[15]報道的方法進行基質(zhì)效應(yīng)評估，選擇牛肝、羊肉、雞蛋、奶粉4種陰性樣品，分別配制相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，按照公式(1)計算基質(zhì)效應(yīng)：

基質(zhì)效應(yīng)

(1)

結(jié)果如圖2所示，矮壯素均存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，且隨著提取溶劑中酸濃度的增加，牛肝、羊肉、奶粉的基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯增強。因此，試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對矮壯素基質(zhì)效應(yīng)的影響(n=3)
Fig.2 Effect of extraction solvent on matrix effect of CCC(n=3)

2.3 QuEChERS凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS方法中常用的吸附劑主要有C18、PSA、GCB等。LI等[9]研究比較了C18、PSA、GCB對肉中矮壯素凈化效率的影響，最終得出采用C18凈化回收率最高(94.7%)，采用GCB凈化回收率只有43.5%，采用PSA凈化回收率則只有32.6%。本研究選取牛肝、羊肉、雞蛋、奶粉4種陰性樣品作為研究對象，比較了C18、PSA、GCB作為凈化吸附劑時(均含100 mg無水硫酸鎂)對樣品中矮壯素凈化效率和回收率的影響。結(jié)果顯示，采用這3種吸附劑凈化提取液，方法回收率能達到80%以上，這與LI等[9]的研究不太一致。試驗發(fā)現(xiàn)，采用C18作為吸附劑，提取液較為澄清但含有部分色素；采用PSA、GCB作為吸附劑，提取液中色素明顯較C18少，但較為渾濁。動物源性樣品中蛋白、脂肪含量較高，且肝臟類樣品中還存在色素、甾醇等雜質(zhì)，采用乙腈作為提取溶劑可以沉淀樣品中蛋白，但也會將樣品中的脂肪、色素等雜質(zhì)提取出來，造成提取液渾濁、色素雜質(zhì)較多等。C18屬于非極性吸附劑，可以從極性樣品中吸附長鏈脂肪類化合物、甾醇類和其他非極性干擾物質(zhì)，而使提取液澄清；PSA的有效成分為其表面鍵合的氨基，它對于提取液中的一些強極性雜質(zhì)、色素和金屬離子等具有良好的凈化效果，可吸附多種色素、糖和脂肪酸等；GCB可以除去具有平面結(jié)構(gòu)的葉綠素、類胡蘿卜素等色素、類固醇和多酚類等。結(jié)合這3種吸附劑的作用機理，且考慮到GCB的價格明顯高于C18和PSA，試驗進一步研究了C18+PSA組合(含100 mg無水硫酸鎂)的凈化效果，并結(jié)合基質(zhì)效應(yīng)對吸附劑含量進行了優(yōu)化。

試驗結(jié)果如圖3所示，C18+PSA組合凈化效果要優(yōu)于單個吸附劑時的效果，對于牛肝、羊肉、雞蛋基質(zhì)樣品，當(dāng)C18+PSA的含量達到(100 mg+100 mg)時，凈化效果已達到最佳，再增加 C18、PSA的含量，其基質(zhì)抑制效應(yīng)并沒有明顯的變化；對于奶粉基質(zhì)樣品，當(dāng)C18+PSA的含量達到(50 mg+100 mg)時，凈化效果已達到最佳，再增加 C18、PSA的含量，其基質(zhì)抑制效應(yīng)并沒有明顯的變化。結(jié)果表明，C18+PSA組合能有效去除提取液中脂肪、色素等雜質(zhì)，最大程度的降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，綜合上述試驗結(jié)果，選擇100 mg C18+100 mg PSA(含100 mg無水硫酸鎂)的組合作為QuEChERS的凈化吸附劑。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

試驗選擇豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、豬肝、牛肝、羊肝、雞肝、雞蛋、奶粉10種陰性樣品，分別配制質(zhì)量濃度為10 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液(均含內(nèi)標(biāo)5 μg/L)，其基質(zhì)效應(yīng)如表3所示。

圖3 吸附劑對矮壯素基質(zhì)效應(yīng)的影響(n=3)
Fig.3 Effect of adsorbent on matrix effect of CCC(n=3)

表3 不同基質(zhì)中矮壯素的基質(zhì)效應(yīng)
Table 3 Matrix effect of CCC in the different matrices

結(jié)果表明，采用外標(biāo)法計算時，肉類、雞蛋樣品表現(xiàn)為弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，奶粉樣品表現(xiàn)為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)，而肝臟類樣品表現(xiàn)為強基質(zhì)抑制效應(yīng)；采用內(nèi)標(biāo)法計算時，這10種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)值為93.6%～99.8%，均為弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，主要是同位素內(nèi)標(biāo)矮壯素-D4的加入可以有效去除基質(zhì)效應(yīng)的影響。因此，方法無需配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 線性范圍和定量限

以矮壯素的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)(x)，矮壯素和矮壯素-D4定量離子的峰面積之比為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為y=0.315 3 x-0.007 507，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。結(jié)果表明，矮壯素在0.05 ～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且滿足GB/T 27404—2008附錄F中相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99的要求。

通過加標(biāo)回收試驗，以最低添加濃度(S/N≥10)作為定量限(limit of quantitation，LOQ)，得到矮壯素的方法定量限如表4所示。結(jié)果顯示，方法定量限完全滿足各國限量標(biāo)準(zhǔn)要求，且與李春梅等[3]報道的SPE法檢測小鼠肌肉中矮壯素的方法相比具有更高的靈敏度，與肖泳等[6]報道的SPE法檢測動物源性食品中矮壯素、LI等[9]報道的分散固相萃取法檢測肉中矮壯素的方法靈敏度相近。

2.4.3 準(zhǔn)確度和精密度

選取豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、豬肝、牛肝、羊肝、雞肝、雞蛋和奶粉10種陰性樣品進行加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)量分別為1.0、20.0、500.0 μg/kg，每個加標(biāo)水平做6個平行，試驗結(jié)果見表4。

表4 不同基質(zhì)中矮壯素的定量限、加標(biāo)回收率和精密度(n=6)
Table 4 LOQ, spiked recoveries and precisions of CCC in the different matrices(n=6)

結(jié)果顯示，在3個加標(biāo)水平下，各基質(zhì)中矮壯素的平均回收率在84%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.13%～6.49%。說明方法的準(zhǔn)確度高，通用性好，且方法的回收率明顯優(yōu)于李春梅等[3]方法的回收率，與肖泳等[6]、LI等[9]報道的方法回收率相近，完全滿足GB/T 27404—2008附錄F中回收率和精密度要求。

2.5 實際樣品的測定

運用本文建立的方法，對市售的116份畜禽肉、53份內(nèi)臟、48份蛋、24份牛奶、30份奶粉樣品進行矮壯素的殘留檢測。結(jié)果表明，271份動物源性樣品中，檢出陽性樣品26份(部分陽性樣品圖譜見圖4)，含量為1.06～14.5 μg/kg。其中，1份羊肉檢出矮壯素，含量為1.77 μg/kg；1份羊肝檢出矮壯素，含量為14.5 μg/kg；2份牛腎檢出矮壯素，含量分別為2.41、2.23 μg/kg；1份雞蛋檢出矮壯素，含量為3.95 μg/kg；8份牛奶檢出矮壯素，含量范圍為1.06～4.56 μg/kg；13份奶粉檢出矮壯素，含量范圍為1.16～10.8 μg/kg，所檢出樣品中矮壯素的含量均低于國家標(biāo)準(zhǔn)對其規(guī)定的最大殘留限量。對于陽性樣品，研究進一步采用肖泳等[6]建立的SPE法進行檢測，結(jié)果顯示，2個方法的檢測結(jié)果相差不大(偏差在10%以內(nèi))。

a-羊肉；b-羊肝；c-牛腎；d-雞蛋；e-牛奶；f-奶粉
圖4 實際樣品中矮壯素的定量離子色譜圖
Fig.4 The quantitative ion chromatograms of CCC in the actual samples

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS法快速測定動物源性食品中矮壯素殘留的分析方法，方法簡便、高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度均滿足方法學(xué)指標(biāo)，方法定量限完全滿足各國限量標(biāo)準(zhǔn)要求，可為動物源性食品中矮壯素殘留的快速檢測提供技術(shù)手段。