基于免疫學(xué)微流控芯片快速檢測(cè)病原體的研究進(jìn)展

食品安全關(guān)系到每個(gè)人的發(fā)展和生存，早期快速的檢測(cè)食源性致病菌可避免病原微生物感染所引起的爆發(fā)性食源性疾病[1]。現(xiàn)有的培養(yǎng)鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等檢測(cè)方法需要專(zhuān)業(yè)人士及設(shè)備，既昂貴又費(fèi)時(shí)。因此，急需尋求一種簡(jiǎn)單、快速及高靈敏度的病原微生物檢測(cè)方法[2]。

微流控芯片提供了一種經(jīng)濟(jì)省時(shí)的檢測(cè)方式，可在極低濃度對(duì)食源性致病菌進(jìn)行快速檢測(cè)[3]。微流控是一種在微米級(jí)尺度下進(jìn)行樣品輸送、反應(yīng)及檢測(cè)的一種技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、高通量、集成度及自動(dòng)化高的優(yōu)點(diǎn)[4-5]。目前，微流控檢測(cè)芯片按照檢測(cè)原理主要分為基于分子生物學(xué)的微流控檢測(cè)芯片、基于電化學(xué)的微流控檢測(cè)芯片及基于免疫學(xué)的微流控檢測(cè)芯片3大類(lèi)。其中，基于免疫學(xué)的微流控檢測(cè)芯片以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)原理，具有檢測(cè)條件寬松、靈敏度高及速度快的特點(diǎn)。免疫微流控檢測(cè)芯片結(jié)合比色法避免了使用外部設(shè)備，可對(duì)食源性致病菌[6]、疾病標(biāo)志物[7]、毒素[8]及激素[9]等多種生物分子進(jìn)行檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)、環(huán)境保護(hù)及臨床診斷等領(lǐng)域[10]。

本課題組致力于將免疫檢測(cè)技術(shù)集成于微流控芯片上進(jìn)行食源性致病菌的快速檢測(cè),已開(kāi)發(fā)出可檢測(cè)大腸桿菌及鮑氏志賀氏菌的免疫微流控檢測(cè)芯片并在進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。研究表明，芯片基底均需不同程度的表面改性處理才可固定抗體用于免疫分析。如聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)的微通道需進(jìn)行超聲清洗及等離子氧化等處理以減少非特異性吸附，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性；紙基襯底由于其多孔親水等特性，可通過(guò)干燥固定免疫分析所用試劑，但當(dāng)通過(guò)表面修飾偶聯(lián)抗體時(shí)才能對(duì)食源性致病菌有較好的捕獲效率。其次，基底的光學(xué)性能及生物相容性等對(duì)芯片的應(yīng)用場(chǎng)景有著基礎(chǔ)性影響，同時(shí)決定著芯片的成本、加工及組裝工藝?；诖?，本文綜述了近年來(lái)免疫微流控檢測(cè)芯片在病原微生物即時(shí)檢測(cè)中的研究進(jìn)展，主要集中在硅基免疫微流控檢測(cè)芯片、高分子聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片及紙基免疫微流控檢測(cè)芯片3部分。最后，討論了免疫微流控檢測(cè)芯片目前面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展機(jī)遇。

1 硅基免疫微流控檢測(cè)芯片

硅基免疫微流控檢測(cè)芯片是以免疫學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)，以硅片、玻璃或石英等為基礎(chǔ)制備的免疫微流控檢測(cè)芯片。20世紀(jì)90年代，MANZ等[11]以硅片為基底首次制備出微流控芯片。由于微流控技術(shù)源于微機(jī)電技術(shù)，成熟的微細(xì)加工技術(shù)使硅成為早期免疫微流控檢測(cè)芯片的常用基底。

硅基片具有良好的生物相容性、化學(xué)惰性、導(dǎo)熱性和熱穩(wěn)定性[12]，對(duì)其表面改性可用于固定抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)[13]。KIM等[14]開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的硅基免疫微流控檢測(cè)芯片(圖1-A)。該微流控檢測(cè)芯片含有1個(gè)蛇形通道(400 μm×50 μm，長(zhǎng)×寬)，1個(gè)檢測(cè)區(qū)、3個(gè)進(jìn)樣孔及1個(gè)出樣孔。結(jié)合沙門(mén)氏菌抗體的量子點(diǎn)預(yù)裝在一個(gè)進(jìn)樣孔，磁球與樣品的混合溶液裝入另一進(jìn)樣孔。兩種溶液在負(fù)壓下進(jìn)入蛇形槽中混合和孵育，改性后的硅表面可配合固定抗體微球復(fù)合物不被輕易沖走，從而進(jìn)行病原微生物的富集與分離。最后，形成的復(fù)合物在永磁體的作用下進(jìn)入檢測(cè)區(qū)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。該芯片對(duì)10份樣品進(jìn)行了特異性檢測(cè)，靈敏度達(dá)到103 CFU/mL。LI等[15]開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的硅基免疫微流控檢測(cè)芯片(圖1-B)。硅基片在銀輔助化學(xué)刻蝕下形成了3D納米線基板，經(jīng)表面化學(xué)修飾后用于檢測(cè)病原微生物(圖1-C)。相對(duì)于扁平化修飾的硅基片，三維立體硅基板經(jīng)表面修飾后對(duì)金黃色葡萄球菌的捕獲率增大了10倍，未修飾的硅基片幾乎沒(méi)有非特異性吸附。研究人員在使用3種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測(cè)時(shí)，捕獲率均在90%左右，靈敏度達(dá)到10 CFU/mL。

A-沙門(mén)氏菌硅基微流控檢測(cè)芯片[14]；B-金黃色葡萄球菌硅基免疫微流控檢測(cè)芯片制備原理[15]； C-金黃色葡萄球菌硅基免疫微流控芯片制備及檢測(cè)原理[15]
圖1 硅基免疫免疫微流檢測(cè)芯片
Fig.1 Silicon-based immunoimmunity microfluidic detection chip

除表面改性外，硅也可通過(guò)加工形成多孔狀態(tài)(即多孔硅)來(lái)提高病原微生物的捕獲率。這是因?yàn)槎嗫坠杈哂懈叩谋缺砻娣e來(lái)固定抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)[16]。然而，多孔硅具有易碎、不透明、彈性模量高(130～180 GPa)及昂貴等缺點(diǎn)。高彈性模量使其難以開(kāi)發(fā)微閥等微器件，不透明性則導(dǎo)致其難以進(jìn)行可視化結(jié)果輸出，這導(dǎo)致其較少用于免疫微流控檢測(cè)芯片的開(kāi)發(fā)應(yīng)用中。

與硅基片相比，玻璃更便宜且擁有不錯(cuò)的光學(xué)透明性。在加工方面，玻璃可通過(guò)蝕刻和光刻工藝形成微通道。組裝時(shí)，玻璃芯片常通過(guò)熱鍵合貼合密封通道。但熱鍵合容易造成玻璃微通道的變形，使得該組裝方式下的玻璃免疫微流控檢測(cè)芯片成品率較低[17]。因此，有研究人員將玻璃與聚合物貼合組裝免疫微流控檢測(cè)芯片。例如，ABDULLAH等[18]開(kāi)發(fā)了一種玻璃基免疫微流控芯片，用于大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)(圖2-A)。該芯片通過(guò)濕法刻蝕等微加工工藝在玻璃基底上制備出微通道、富集區(qū)，檢測(cè)區(qū)及4個(gè)進(jìn)出樣口。通過(guò)彈性聚合物聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)密封通道不會(huì)損壞微通道，也不會(huì)對(duì)后續(xù)的抗體固定化及免疫分析造成影響(圖2-B)。捕獲抗體事先通過(guò)共價(jià)結(jié)合在修飾后的玻璃表面，檢測(cè)抗體通過(guò)非特異性吸附固定在檢測(cè)電極上。檢測(cè)時(shí)，先注入檢測(cè)抗體將其固定。洗滌后，通入含有病原菌的樣品溶液并調(diào)節(jié)電極參數(shù)富集病原菌。最后，芯片內(nèi)斜向下的電極將富集的病原菌推向檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)區(qū)電極上檢測(cè)抗體與病原菌結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)電極的阻抗變化來(lái)確定樣品中的病原菌含量，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限分別達(dá)到了10、13 cell/mL。

此外，玻璃也可用于開(kāi)發(fā)數(shù)字免疫微流控檢測(cè)芯片。玻璃數(shù)字免疫微流控檢測(cè)芯片以液滴為對(duì)象，在玻璃基底上形成圖案并固定電極，通過(guò)電極上適宜的電位序列精確操控液滴，完成混合、分離及反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)操作[19]。與通道型免疫微流控芯片相比，數(shù)字免疫微流控芯片能夠保證磁球等微固體流動(dòng)時(shí)不發(fā)生堵塞通道的風(fēng)險(xiǎn)。COUDRON等[20]研制的數(shù)字免疫微流控系統(tǒng)集抗體固定、抗原檢測(cè)、磁分離及信號(hào)輸出等操作于一體，實(shí)現(xiàn)了病原微生物的全自動(dòng)化免疫檢測(cè)(圖2-C)。運(yùn)行時(shí)依次將捕獲抗體包被的磁珠、抗原及檢測(cè)抗體通入芯片，并使用通用平行板配置運(yùn)行。該平行板可將1.5～3 μL的液滴夾在傳動(dòng)板和導(dǎo)電接地蓋板的疏水表面之間，從而完成磁珠的提取、再懸浮及混合等操作。與基于流動(dòng)的微流體相比，該芯片可在沒(méi)有高剪應(yīng)力的情況下快速改變磁珠濃度以完成抗原的富集和檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光輸出檢測(cè)結(jié)果，發(fā)光強(qiáng)度取決于抗原捕獲量。為驗(yàn)證其性能，該芯片以大腸桿菌、芽孢桿菌及噬菌體病毒為靶標(biāo)進(jìn)行了全自動(dòng)檢測(cè)，檢測(cè)限分別為2×107 CFU/mL、4×104 CFU/mL及106 PFU/mL。該芯片采用全自動(dòng)化磁分離，將檢測(cè)時(shí)間縮短至6～10 min，解決了傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)的的勞動(dòng)密集型缺點(diǎn)。目前，玻璃基數(shù)字免疫微流控檢測(cè)芯片已廣泛應(yīng)用于免疫分析及細(xì)胞研究等領(lǐng)域[21]。

A-玻璃免疫微流控檢測(cè)芯片[18]；B-濕法刻蝕和熔融黏合制造微芯片[18]；C-數(shù)字微流控芯片設(shè)計(jì)概覽及運(yùn)行中的數(shù)字微流控芯片[20]
圖2 硅基免疫微流控檢測(cè)芯片
Fig.2 Silicon-based immunomicrofluidic detection chip

除硅片和玻璃免疫微流控外，石英基免疫微流控檢測(cè)芯片也被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于食源性致病菌的快速檢測(cè)。石英同樣具有良好的化學(xué)惰性、生物相容性及耐有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)，且擁有最優(yōu)秀的光學(xué)特性[22]。然而，石英需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的表面處理才可用于固定抗體。此外，石英免疫微流控檢測(cè)芯片的加工工藝復(fù)雜，費(fèi)用昂貴。這導(dǎo)致石英大多用于單分子檢測(cè)等特殊檢測(cè)領(lǐng)域，較少的用于食源性致病菌檢測(cè)。

綜上所述，硅基免疫微流控檢測(cè)芯片具有加工精度及檢測(cè)靈敏度較高的特點(diǎn)，但復(fù)雜的加工工藝及高成本導(dǎo)致硅基免疫微流控檢測(cè)芯片多用于實(shí)驗(yàn)室科研[23]。雖然硅基底可與聚合物結(jié)合用于制備微泵、微閥等微器件以適應(yīng)免疫微流控檢測(cè)芯片高集成的要求，但這卻削弱了玻璃和石英良好的光學(xué)性能等優(yōu)勢(shì)[24]。

2 聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片

聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片指的是以高分子聚合物為基底，以免疫學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的微流控檢測(cè)芯片[25]。聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片具有價(jià)格低、品類(lèi)多、彈性優(yōu)良、生物相容性及光學(xué)透明性好等優(yōu)點(diǎn)[26]，是硅基免疫微流控檢測(cè)芯片的替代品。常見(jiàn)的聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片主要有PDMS、PMMA、聚碳酸酯(polycarbonate，PC)及聚苯乙烯(polystyrene，PS)免疫微流控檢測(cè)芯片。其中，PDMS可跟PDMS、玻璃、石英或其他聚合物通過(guò)鍵合等方式結(jié)合在一起制備免疫微流控芯片，具有加工簡(jiǎn)便、成本低和可大規(guī)模制備等特點(diǎn)。EFFENHAUSER等[27]于20世紀(jì)90年代末首次開(kāi)發(fā)出PDMS微流控芯片，軟光刻技術(shù)的出現(xiàn)則推動(dòng)了PDMS免疫微流控檢測(cè)芯片的快速發(fā)展，是目前應(yīng)用最為廣泛的聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片之一[28]。

值得注意的是，PDMS的彈性模量低(300～500 kPa)，可用于制造微泵、微閥、微混合器及微檢測(cè)器等微器件[29]。CAI等[30]開(kāi)發(fā)了一種一次性視覺(jué)免疫微流控檢測(cè)芯片，采用免疫磁分離、酶催化和距離指示技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌(圖3-A)。該微流控檢測(cè)芯片主體為PDMS，含有1個(gè)動(dòng)力驅(qū)動(dòng)孔、3個(gè)進(jìn)出樣孔、2個(gè)儲(chǔ)液室、微混合區(qū)及距離指示通道。芯片內(nèi)微混合器固定有抗體修飾的磁球，用于富集樣品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌。富集后的復(fù)合物與抗體和過(guò)氧化氫酶共同修飾的聚苯乙烯微球偶聯(lián)，形成免疫磁球-細(xì)菌-聚苯乙烯酶夾心復(fù)合物。復(fù)合物上的過(guò)氧化氫酶通過(guò)微型混合器后催化過(guò)氧化氫分解生成氧氣，產(chǎn)生的氧氣增加了芯片中的壓力，并推動(dòng)指示紅色染料溶液沿著通道向未密封的出口移動(dòng)，通過(guò)移動(dòng)距離反映樣品中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的數(shù)量。該免疫微流控芯片內(nèi)制備的微混合器通過(guò)富集病原微生物使其檢測(cè)靈敏度達(dá)到了150 CFU/mL，基于視覺(jué)輸出檢測(cè)結(jié)果而不需要外部設(shè)備。

然而，PDMS等表面疏水的聚合物易導(dǎo)致疏水分子的非特異性吸附和滲透，影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此，研究人員通過(guò)聚合物表面改性或使用聚合物微球來(lái)固定抗體以適應(yīng)免疫微流控檢測(cè)芯片的開(kāi)發(fā)。

ALTINTAS等[31]設(shè)計(jì)并制造了一種用于大腸桿菌全自動(dòng)檢測(cè)的免疫微流控檢測(cè)芯片，研究了聚合物表面改性后修飾納米顆粒對(duì)抗體固定的影響(圖3-C)。一方面，芯片基底經(jīng)表面改性后直接固定抗體，采用抗體-細(xì)菌-抗體的標(biāo)準(zhǔn)夾心法檢測(cè)大腸桿菌。另一方面，芯片基底表面改性后引入納米顆粒固定抗體。辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記另一抗體作為檢測(cè)抗體，在細(xì)菌被捕獲后形成固定化的納米顆?？贵w-細(xì)菌-酶標(biāo)抗體夾心體，HRP催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)產(chǎn)生氧化還原信號(hào)輸出。結(jié)果表明，引入納米顆粒后的微流控免疫檢測(cè)芯片對(duì)大腸桿菌的檢出限為50 CFU/mL，與未引入納米顆粒的標(biāo)準(zhǔn)夾心法相比，靈敏度提高了近400倍。王嶺[32]開(kāi)發(fā)了一種PS免疫微流控檢測(cè)芯片，用于玉米萎蔫病菌的快速檢測(cè)(圖3-D)。該芯片通過(guò)熱壓鍵合黏合基板，中間夾層的PS薄膜微閥可控制流體進(jìn)出。檢測(cè)時(shí)樣品被干燥在芯片內(nèi)部，通過(guò)微閥依次泵入HRP標(biāo)記的抗體及洗液，最后加入顯色底物顯色完成檢測(cè)。該芯片在程序軟件及PS薄膜微閥的配合下實(shí)現(xiàn)了致病菌的全自動(dòng)免疫檢測(cè)。該芯片與傳統(tǒng)ELISA法的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)，但試劑消耗量減少了25倍，時(shí)間降低了10倍。CHOI等[33]開(kāi)發(fā)了一種自動(dòng)化快速檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的免疫微流控芯片(圖3-E)。該芯片的PC薄膜基底經(jīng)表面改性后用于捕獲抗體的固定化，熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體則被噴射在反應(yīng)室中。樣品中的目標(biāo)抗原注入芯片后首先與檢測(cè)抗體結(jié)合，之后流向檢測(cè)室與捕獲抗體結(jié)合形成抗體-抗原-熒光標(biāo)記抗體復(fù)合物，通過(guò)熒光信號(hào)輸出檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)改性后的PC薄膜固定抗體使其靈敏度達(dá)到了50 ng/mL，高于商用試劑盒的靈敏度(200 ng/mL)。雖然聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片經(jīng)表面處理或集成微器件提高了檢測(cè)靈敏度，降低了檢測(cè)時(shí)間，但離不開(kāi)復(fù)雜的加工及組裝設(shè)備。同時(shí)，在抗體固定化方面前處理步驟過(guò)多，或許紙基免疫微流控檢測(cè)芯片能更好的處理該問(wèn)題[34]。

A-視覺(jué)免疫微流控檢測(cè)芯片實(shí)物圖及其概念圖[30]；B-視覺(jué)免疫微流控芯片檢測(cè)原理[30]；C-免疫微流控芯片設(shè)計(jì)圖及其檢測(cè)原理[31]； D-PS免疫微流控芯片結(jié)構(gòu)圖[32]；E-PC薄膜免疫微流控芯片結(jié)構(gòu)圖及檢測(cè)流程[33]
圖3 聚合物免疫微流控檢測(cè)芯片
Fig.3 Polymer immunomicrofluidic detection chip

3 紙基免疫微流控檢測(cè)芯片

紙基免疫微流控芯片又稱(chēng)“紙芯片”，是一種利用紙(如濾紙和硝酸纖維素膜等)替代傳統(tǒng)的硅基底或聚合物基底進(jìn)行免疫檢測(cè)的微流控芯片。紙是由纖維素組成的高度多孔基質(zhì)，與硅、玻璃、石英及高分子聚合物等微流控檢測(cè)芯片基底相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)原料豐富，成本低；(2)環(huán)保無(wú)害，可通過(guò)焚燒、生物降解等方式處理；(3)使用靈活，紙的多孔性結(jié)構(gòu)允許進(jìn)行流體的流動(dòng)、過(guò)濾及分離等操作；(4)良好的親水性；(5)可一次性使用和大規(guī)模生產(chǎn)[35-37]。因此，紙基免疫微流控檢測(cè)芯片已廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境檢測(cè)及臨床診斷等領(lǐng)域。

在加工工藝方面，紙基免疫微流控檢測(cè)芯片可通過(guò)噴墨印刷、柔性版印刷及蠟印刷等印刷技術(shù)或光刻、沖壓、剪切和壓印等其他加工技術(shù)來(lái)制備[38]。其中，蠟網(wǎng)印刷是紙基免疫微流控芯片制應(yīng)用較為普遍的一種加工方式。蠟印可在紙基表面建造疏水屏障和親水通道，具有制備簡(jiǎn)便、成本低且無(wú)需密封通道的特點(diǎn)[39]。由于親水通道和疏水屏障的毛細(xì)效應(yīng)，紙基免疫微流控檢測(cè)芯片在進(jìn)行免疫分析時(shí)無(wú)需外部設(shè)備，實(shí)現(xiàn)了免疫檢測(cè)的低成本和便攜性。紙的高比表面積微孔結(jié)構(gòu)和易于表面改性等優(yōu)勢(shì)使其可用于抗體固定、抗原抗體的孵育結(jié)合及化學(xué)發(fā)光反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)，更有利于制備免疫微流控檢測(cè)芯片[40]。

一般情況下，紙基免疫微流控檢測(cè)芯片由一層紙制成，僅限于二維通道網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)將兩層或多層紙基底疊加在一起時(shí)，會(huì)產(chǎn)生基于紙襯底的三維紙基免疫微流控檢測(cè)芯片，允許流體在三維空間進(jìn)行流動(dòng)。由于紙張很薄，將多張紙堆疊在一起可增加通道密度，而不會(huì)改變?cè)O(shè)備大小。這使得三維紙基免疫微流控檢測(cè)芯片能夠在更短的時(shí)間內(nèi)完成更復(fù)雜的流體處理。如圖4所示，

A-三維紙基芯片制備原理[41]；B-三維紙基芯片檢測(cè)沙門(mén)氏菌原理圖(a-紙芯片檢測(cè)原理，b-紙芯片折疊原理)[41]； C-紙基免疫微流控芯片結(jié)合智能手機(jī)檢測(cè)病原菌(a-入射光角度，b-檢測(cè)光角度)[41]；D-紙基免疫微流控芯片結(jié)合旋轉(zhuǎn)框架結(jié)構(gòu)圖及實(shí)物圖[41]
圖4 紙基免疫微流控檢測(cè)芯片
Fig.4 Paper-based immunomicrofluidic detection chip

CHEN等[41]開(kāi)發(fā)了一種三維折紙免疫微流控檢測(cè)芯片(圖4-A)。該芯片通過(guò)蠟印制備疏水區(qū)域，分別通過(guò)表面干燥和表面改性固定免疫分析所用試劑。折疊滑動(dòng)芯片可使分析物在各紙層間進(jìn)行垂直擴(kuò)散，輕松執(zhí)行免疫分析所需步驟，極大的提高了檢測(cè)效率。在實(shí)際應(yīng)用性能方面，該芯片成功檢測(cè)到樣品中的金黃色葡萄球菌。在以人免疫蛋白作為模型對(duì)三維折紙免疫微流控檢測(cè)芯片進(jìn)行優(yōu)化后，檢測(cè)時(shí)間最短縮短至7 min，檢測(cè)限達(dá)到了0.01 ng/mL。相比傳統(tǒng)的ELISA、熒光免疫檢測(cè)、免疫熒光法及斑點(diǎn)ELISA等免疫檢測(cè)方式，上述三維折紙免疫微流控檢測(cè)芯片的檢測(cè)效率更高，在食源性致病菌的快速檢測(cè)上具有極大的應(yīng)用潛力。

比色法作為一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)策略，常與紙基免疫微流控檢測(cè)芯片結(jié)合使用，降低了紙基免疫微流控檢測(cè)芯片的成本并提高了其便攜性[42]。然而，傳統(tǒng)的比色法僅能進(jìn)行定性分析，低靈敏度和高檢測(cè)限制了紙基免疫微流控檢測(cè)芯片的更大規(guī)模應(yīng)用。因此，有研究人員通過(guò)改變紙基免疫微流控芯片的信號(hào)輸出模式來(lái)定量檢測(cè)病原微生物。例如，PARK等[43]開(kāi)發(fā)了一種與智能手機(jī)相結(jié)合檢測(cè)沙門(mén)氏菌的紙基免疫微流體檢測(cè)芯片(圖4-C)。紙基底經(jīng)光刻蝕刻形成微通道，在通道內(nèi)預(yù)裝抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗體標(biāo)記的微粒形成檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)時(shí)將紙質(zhì)微流控裝置浸入含有鼠傷寒沙門(mén)氏菌的溶液中，預(yù)裝在芯片內(nèi)的抗體微粒與菌結(jié)合形成微粒-細(xì)菌復(fù)合物。檢測(cè)區(qū)的光散射強(qiáng)度與樣品中病原微生物數(shù)量呈反比，通過(guò)簡(jiǎn)單的圖像處理和算法計(jì)算后得出細(xì)菌濃度，實(shí)現(xiàn)了紙基免疫微流控芯片對(duì)沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。該紙基免疫微流控芯片的檢測(cè)下限為100 CFU/mL，總檢測(cè)時(shí)間<1 min，遠(yuǎn)低于ELISA等傳統(tǒng)方法定量檢測(cè)食源性致病菌所需1 h或過(guò)夜的檢測(cè)時(shí)間。

相對(duì)于單一紙基底的免疫微流控檢測(cè)芯片來(lái)說(shuō)，引入3D打印結(jié)合聚合物制備的紙基免疫微流控檢測(cè)芯片能夠使兩者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，更有利于食源性致病菌的快速檢測(cè)[44]。例如，CARRELL等[45]開(kāi)發(fā)了一種紙與3D打印旋轉(zhuǎn)框架相結(jié)合可重復(fù)使用的免疫微流控芯片，用以沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)(圖4-D)。該免疫微流控檢測(cè)芯片通過(guò)紙基襯底快速而準(zhǔn)確的固定顯色底物修用以檢測(cè)結(jié)果的信號(hào)輸出，而不需要復(fù)雜的表面修飾。3D旋轉(zhuǎn)聚合物框架則用于放置紙基芯片，在離心力的作用下驅(qū)動(dòng)溶液的流動(dòng)進(jìn)行洗滌，實(shí)現(xiàn)了試劑的輸送、洗滌和檢測(cè)自動(dòng)化。檢測(cè)時(shí)從樣品孔注入含有病原菌的樣品溶液，修飾后的紙基芯片結(jié)合外部永磁體固定免疫磁球?qū)Σ≡M(jìn)行富集。洗滌后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，形成免疫磁球-細(xì)菌-檢測(cè)抗體復(fù)合物。該復(fù)合物表面含生物素，可與帶有鏈霉親和素的半乳糖苷酶相結(jié)合。最終，半乳糖苷酶與固定好的顯色底物發(fā)生反應(yīng)，芯片由黃變紅即表明樣品中含有病原菌。該免疫微流控檢測(cè)芯片以沙門(mén)氏菌為目標(biāo)病原菌，分別在培養(yǎng)基和牛奶中進(jìn)行培養(yǎng)，檢出限分別達(dá)到了4.4×102、6.4×102 CFU/mL。該紙基微流控芯片與傳統(tǒng)的紙基分析設(shè)備相比，避免了洗滌步驟而沒(méi)有影響其檢測(cè)性能，為商業(yè)化提供了一種實(shí)用的產(chǎn)品。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，本文討論了基于免疫學(xué)的微流控芯片在食源性致病菌快速檢測(cè)方面的應(yīng)用與進(jìn)展,介紹了各免疫微流控檢測(cè)芯片特性(表1)及其相應(yīng)的免疫微流控檢測(cè)芯片在病原微生物上的檢測(cè)性能(表2)。免疫微流控檢測(cè)芯片在病原微生物的快速檢測(cè)上具有傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法比擬的顯著優(yōu)點(diǎn)，例如試劑和樣品的低消耗量、成本低、檢測(cè)環(huán)境要求低、檢測(cè)速度快、高通量、高度集成及操作自動(dòng)化等。此外，由于免疫微流控檢測(cè)芯片具有高比表面及抗體固定化等優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，檢測(cè)靈敏度也得到了提高。

表1 常見(jiàn)3種免疫微流控檢測(cè)芯片的特性
Table 1 Performance comparison of 3 common immune microfluidic chips

表2 免疫微流控檢測(cè)芯片的性能比較
Table 2 Comparison of commonly used immune microfluidic detection chips

值得注意的是，雖然免疫微流控檢測(cè)技術(shù)發(fā)展?jié)摿薮?，但仍有一些挑?zhàn)阻礙其大規(guī)模應(yīng)用。首先，制備并組裝芯片并沒(méi)有設(shè)計(jì)時(shí)看上去那么簡(jiǎn)單，需用光刻機(jī)和真空熱壓鍵合機(jī)等專(zhuān)業(yè)機(jī)器及嚴(yán)格的加工工藝。其次，芯片內(nèi)可能出現(xiàn)的死體積使得檢測(cè)結(jié)果存在不穩(wěn)定性，長(zhǎng)期的低溫存儲(chǔ)也會(huì)對(duì)預(yù)裝載試劑造成損害，用于結(jié)果輸出的外部設(shè)備也使其檢測(cè)的便攜性受到影響。目前，大多數(shù)免疫微流控檢測(cè)芯片僅用于病原體的快速定性檢測(cè)，在區(qū)分活菌和死菌方面仍有待研究。因此，免疫微流控檢測(cè)芯片在開(kāi)發(fā)時(shí)應(yīng)簡(jiǎn)化制備方法，去除死體積的影響來(lái)增加結(jié)果的可靠性。在輸出結(jié)果時(shí)減少使用外部設(shè)備或開(kāi)發(fā)小型化外部設(shè)備，將微流控芯片的便攜性最大化。同時(shí)，探索能夠區(qū)分活菌與死菌的免疫微流控芯片研究方案，進(jìn)一步提高其應(yīng)用性能。在免疫微流控檢測(cè)芯片開(kāi)發(fā)時(shí)若能考慮并解決上述問(wèn)題，那么最終開(kāi)發(fā)的免疫微流控檢測(cè)芯片將有更廣泛的應(yīng)用并對(duì)基礎(chǔ)科學(xué)研究產(chǎn)生重大影響。