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羥基磷灰石-氧化石墨烯復(fù)合微球的制備及性能

作者：袁秋華石鑫吳文珊代小毅鐘駿熙楊袁簡(jiǎn)友亮李瑞龍王濤來(lái)源：《深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版)》日期：2022-10-10人氣：2607

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）又稱堿式磷酸鈣，化學(xué)式為Ca（5 PO₄）（3 OH），是牙齒和骨骼的主要無(wú)機(jī)組成成分，因HA具有良好的生物相容性、生物活性和生物降解性，在醫(yī)療材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛^[1-2]．另外，由于HA具有離子交換特性，在廢水處理方面也有廣泛的應(yīng)用^[3-4]．HA可降解吸收，對(duì)人體基本不存在毒副作用，因此可作為藥物載體材料使用^[5]．但是HA作為生物材料單獨(dú)使用時(shí)脆性較大，且韌性較低^[6]，為HA提高的力學(xué)性能，目前主要是將HA與其他高分子材料進(jìn)行復(fù)合^[7-8]．

氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯的衍生物，其單層碳原子構(gòu)成的二維空間的基面連接有大量親水性官能團(tuán)，可以與其他的官能團(tuán)進(jìn)行?；王セ裙矁r(jià)反應(yīng)^[9]，具有超強(qiáng)吸附能力，對(duì)親/疏水藥物可以高負(fù)載．同時(shí)，在生物環(huán)境中，GO具有良好的相容性、分散性、較高的載藥量和良好的緩釋特性等特點(diǎn)，能有效解決藥物易團(tuán)聚和藥效短等問(wèn)題^[10]．

姜黃素（curcumin，Cur）是植物界很稀少的具有二酮的色素，其形態(tài)為橙黃色結(jié)晶粉末，味稍苦，不溶于水，可溶于乙醇和冰醋酸，常作為食用色素使用．有研究證明，姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽和抗氧化等作用^[11]．姜黃素的分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)活性酚結(jié)構(gòu)，因此具有一定的抗氧化能力．作為一種天然酚性物質(zhì)，Cur還含有抗腫瘤和消炎物質(zhì)，且有抗氧化特性，能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡^[12]．此外，Cur通過(guò)抑制核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路激活^[13]和降低組織內(nèi)活性氧水平等方式可延緩椎間盤退變進(jìn)程^[14-15]．但Cur在水溶液中的溶解度不高，穩(wěn)定性差，而且在人體腸道內(nèi)代謝快，生物利用率低，不能很好地發(fā)揮Cur的作用^[16]．因此，為提高Cur的穩(wěn)定性與利用效率，將Cur作為目標(biāo)藥物模型進(jìn)行載藥復(fù)合微球的測(cè)試，為Cur治療食管癌、膝關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病和糖尿病等提供參考．

模板法先通過(guò)較為簡(jiǎn)單方便的途徑合成模板，再通過(guò)物理或化學(xué)方法將目標(biāo)產(chǎn)物合成到模板上，去除模板后便可得到具有模板形貌與尺寸的目標(biāo)產(chǎn)物，分為硬模板法和軟模板法^[17]．本研究以合成的球狀碳酸鈣作為硬模板，通過(guò)水熱法以離子交換方式成功制備了球狀中空的HA-GO復(fù)合微球，并通過(guò)X射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRD）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spec?troscopy，F(xiàn)TIR）、拉曼紅外光譜、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope， FESEM）和紫外可見(jiàn)光近紅外分光光度計(jì)（ultravio?let visible near-infrared spectrophotometers， UV-Vis-NIR）等測(cè)試手段對(duì)合成的復(fù)合微球進(jìn)行表征分析，同時(shí)對(duì)其載藥和釋藥等性能進(jìn)行研究．

1 實(shí) 驗(yàn)

1. 1 試劑與儀器

試劑：磷酸氫二鈉（（NH₃）₂HPO₄）和二水氯化鈣（CaCl₂·2H₂O）購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；碳酸鈉（Na₂CO₃）、檸檬酸（C₆H₈O₇）和無(wú) 水乙醇（CH₃CH₂OH）購(gòu)自廣州市東紅化工廠；姜黃素（C₂₁H₂₀O₆，藥用級(jí)別，98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；氧化石墨烯購(gòu)自湖南豐化材料發(fā)展有限公司；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司.

儀器：主要有日本島津傅里葉變換紅外光譜儀、德國(guó)Bruker的（D8-ADVANCE）X射線粉末衍射儀、日本電子株式會(huì)社公司的JSM-7800&TEAM型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、英國(guó)雷尼紹公共有限公司的InVia Reflex型激光顯微共聚焦拉曼紅外光譜儀以及Micromeritics公司的全自動(dòng)比表面積與孔隙度分析儀.

1. 2 復(fù)合微球的制備

1. 2. 1 CaCO₃-GO微球的合成

制備不同反應(yīng)初始濃度的CaCl₂溶液與Na₂CO₃溶液，向CaCl₂溶液中加入0. 5 mol/L的檸檬酸控制劑攪拌溶解，加入質(zhì)量濃度為0. 1 mg/mL的GO超聲分散30 min，用1. 0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=5. 8．將Na₂CO₃溶液倒入CaCl₂的混合溶液中，同時(shí)迅速攪拌，調(diào)節(jié)pH≈11，攪拌1 h，靜置沉淀22 h．用去離子水和乙醇洗滌多次，于烘箱60～70℃干燥，制得CaCO₃-GO模板．根據(jù)CaCl₂溶液與Na₂CO₃溶液的反應(yīng)初始濃度共設(shè)4組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)中c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃），依次為0. 1、0. 3、0. 5和1. 0 mol/L，獲得的CaCO₃-GO模板對(duì)應(yīng)記作0. 1CaCO₃-GO、0. 3CaCO₃-GO、0. 5CaCO₃-GO和1. 0CaCO₃-GO.

1. 2. 2 HA-GO復(fù)合微球的制備

分別稱取4種不同初始濃度下制備的CaCO₃-GO樣品各1. 0 g，各自加入到50 mL去離子水中，再加入0. 06 mol/L（NH₄）₂ HPO₄攪拌溶解，用1. 0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH≈11．于180℃下將混合溶液在反應(yīng)釜中反應(yīng)，控制水熱反應(yīng)時(shí)間．待反應(yīng)結(jié)束后，水洗3～5次，干燥后收集．實(shí)驗(yàn)對(duì)水熱反應(yīng)時(shí)間（分別為3、6和12 h）和不同初始濃度制備的CaCO₃-GO兩個(gè)因素通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究分析． 4種CaCO₃-GO模板生成的HA-GO產(chǎn)物對(duì)應(yīng)標(biāo)記為0. 1HA-GO、0. 3HA-GO、0. 5HA-GO和1. 0HA-GO.

1. 3 細(xì)胞毒性分析

依據(jù)ISO 10993. 1-2018醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)載體材料進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性^[18]．稱取0. 9 g樣品浸泡在無(wú)水乙醇24 h，過(guò)濾干燥后紫外消毒滅菌．再將樣品浸泡在20 mL的完全培養(yǎng)基中，37℃、CO₂恒溫培養(yǎng)浸提24 h，采用微孔濾膜過(guò)濾，收回浸提液．并以此浸提液濃度為基準(zhǔn)劃分體積分?jǐn)?shù)梯度，依次為 1. 0%、 5. 0%、 10. 0%、 20. 0%、 50. 0%、70. 0%、80. 0%和100. 0%的浸提液和完全培養(yǎng)基9個(gè)梯度，以完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組，其余作為實(shí)驗(yàn)組．將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞接種于96孔板，每組10孔．各組分別加入200 μL對(duì)照培養(yǎng)液或不同濃度的浸提液．培養(yǎng)72 h后，在每孔加入CCK-8試劑，輕微震蕩后繼續(xù)放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 h后用實(shí)時(shí)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔在450 nm波長(zhǎng)處的光密度值D（4 5 0），實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)5次，取平均值，計(jì)算得出細(xì)胞相對(duì)增殖率.

1. 4 微球包封率及載藥量分析

配制一系列姜黃素?zé)o水乙醇溶液測(cè)定吸光度，計(jì)算回歸方程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.

分別稱取4種CaCO₃-GO模型生成的HA-GO樣品各50 mg，將它們置于姜黃素的乙醇溶液中勻速混合24 h．在8 000 r/min下離心15 min，分離并收集上清液，重復(fù)加入無(wú)水乙醇離心，使收集到的上清液總量為20 mL．測(cè)量上清混合液的光密度，通過(guò)與之前姜黃素乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算微球的載藥量和包封率，并設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)以減少誤差．同時(shí)取空白樣，置于無(wú)水乙醇中同樣操作，排除空白微球的浸出物對(duì)測(cè)試過(guò)程的影響．包封率和載藥量的計(jì)算公式為

1. 5 微球體外釋藥測(cè)定

按2015版中國(guó)藥典的規(guī)定對(duì)載藥微球進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)^[19]，釋放溶液使用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液來(lái)模擬人工胃液（pH=1. 5）. 稱取50 mg載藥樣品，放入透析袋中，然后放入釋放溶液中，在37℃水浴條件下攪拌，進(jìn)行藥物緩釋實(shí)驗(yàn)．分別于0. 5、1、2、4、8、12、24、48、72和96 h時(shí)取出4 mL釋放溶液，同時(shí)補(bǔ)充4 mL模擬的人工胃液，測(cè)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)釋放溶液的在波長(zhǎng)為（427 ± 1）nm處吸光度，同樣進(jìn)行3個(gè)平行樣測(cè)試，減小誤差．緩沖液中藥物的累積釋放率E為其中， V₀為緩沖溶液的總體積（單位： mL）； V為每次取出緩沖溶液的體積（單位： m L ）； ρ_n為第n次吸取緩沖溶液時(shí)測(cè)定的藥物質(zhì)量濃度（單位：mg/mL）；ρ_i為第i次置換取樣時(shí)測(cè)定的藥物溶液質(zhì)量濃度（單位：mg/mL）；m (藥物)為載藥微球中包裹的藥物質(zhì)量（單位：mg） .

2 結(jié)果與討論

2. 1 四種CaCO₃-GO的XRD表征

圖1為不同反應(yīng)濃度條件下制備的CaCO₃-GO的XRD圖譜．碳酸鈣主要有文石、方解石和球霰石3種無(wú)水結(jié)晶相．方解石是熱力學(xué)最穩(wěn)定，能量最低的晶型，而球霰石是熱力學(xué)最不穩(wěn)定．能量最高，文石介于兩者之間^[20]．低反應(yīng)濃度（c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）=0. 1 mol/L）與高反應(yīng)濃度（c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）=1. 0 mol/L）得到的XRD圖譜顯示均為方解石晶型，根據(jù)比對(duì)方解石的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#05-0586），圖譜的強(qiáng)衍射峰基本與方解石的（104）、（018）和（116）等晶面符合，進(jìn)而可以判斷合成的為方解石的碳酸鈣．對(duì)比球霰石的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#33-0268），在0. 3 mol/L反應(yīng)條件下，出現(xiàn)球霰石的衍射峰，其（112）和（114）晶面衍射峰強(qiáng)度很高，不過(guò)仍然顯示存在方解石的衍射峰．在0. 5 mol/L時(shí)，也可以明顯看出兩種晶型的衍射峰同時(shí)存在，但方解石的衍射峰強(qiáng)度強(qiáng)一些．說(shuō)明在低反應(yīng)濃度時(shí)生成的主要是熱力學(xué)較穩(wěn)定的方解石晶型的CaCO₃，在增大反應(yīng)濃度后，部分方解石晶型向球霰石晶型轉(zhuǎn)化，但濃度增大到一定程度時(shí)，存在形式又轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的方解石．說(shuō)明反應(yīng)濃度確實(shí)影響碳酸鈣的晶型變化，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)濃度下可以生成球霰石晶型．GO的特征衍射峰在2θ=11. 7°處，可能由于本實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)度太弱，沒(méi)有檢測(cè)到．

圖1 不同反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO的XRD圖譜Fig. 1 The XRD patterns of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

2. 2 四種CaCO₃-GO的FTIR表征

圖2為不同反應(yīng)濃度度條件下制備的CaCO₃-GO的FTIR圖譜．由圖2可見(jiàn)，c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）分別為0. 1 mol/L和1. 0 mol/L制備的樣品中在712 cm^-1處有明顯吸收峰，屬于方解石的CO₃^2-基團(tuán)的O—C—O面內(nèi)變形振動(dòng)峰．而0. 5 mol/L樣品在745 cm^-1處出現(xiàn)吸收峰，這屬于球霰石的CO₃^2-基團(tuán)的O—C—O面內(nèi)變形振動(dòng)峰，同時(shí)也在712 cm^-1有明顯吸收峰，說(shuō)明方解石與球霰石2種晶型共存．當(dāng)反應(yīng)濃度為0. 3 mol/L時(shí)，712 cm^-1處的吸收峰較弱，不太明顯；745 cm^-1處的球霰石吸收峰比較明顯而且清晰，說(shuō)明此樣品主要是球霰石型的CaCO₃，這也與上述XRD分析結(jié)果一致.

圖2 不同反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO的FTIR圖譜Fig. 2 FTIR images of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

2. 3 四種CaCO₃-GO的FESEM表征

圖3為不同反應(yīng)濃度制備的CaCO₃-GO的FESEM圖像．從圖3可明顯看出，低反應(yīng)濃度時(shí)合成的是棒狀顆粒，長(zhǎng)度為1. 0～2. 5 μm，直徑在100～200 nm，呈束狀聚集（如0. 1 mol/L時(shí)）；當(dāng)反應(yīng)濃度增大到0. 3 mol/L時(shí)，出現(xiàn)球狀顆粒，且表面光滑，球狀比較完整，部分呈橢球狀，夾雜少許棒狀顆粒，球形的粒徑為0. 9～2. 0 μm，粒徑分布比較均勻；當(dāng)濃度增至0. 5 mol/L時(shí)，球狀減少，多呈圓餅狀且大小不一，同時(shí)還有不太規(guī)則的棒狀存在；當(dāng)高反應(yīng)濃度1. 0 mol/L時(shí)，基本上沒(méi)有微米級(jí)的可辨識(shí)形貌，只有納米顆粒呈團(tuán)聚分布．從圖3可明顯看出，反應(yīng)濃度對(duì)碳酸鈣是否能呈現(xiàn)微球狀的形貌有重要的影響.

圖3 （a）0. 1CaCO3-GO、（b）0. 3CaCO3-GO、（c）0. 5CaCO3-GO和（d）1. 0CaCO3-GO的FESEM圖像Fig. 3 FESEM images of (a) 0. 1CaCO3-GO, (b) 0. 3CaCO3-GO, (c) 0. 5CaCO3-GO, and (d) 1. 0CaCO3-GO.

2. 4 四種HA-GO的XRD分析

圖4為4種不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO₃-GO水熱后生成的HA-GO的XRD圖譜．總體來(lái)看，碳酸鈣的衍射峰基本消失．與HA的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF# 09-0432）對(duì)比可以看出，不同反應(yīng)濃度下生成的HA-GO復(fù)合物均出現(xiàn)HA的特征衍射峰^[21-22]．說(shuō)明CaCO₃轉(zhuǎn)化成了HA，且純度也比較高．同時(shí)，在2θ≈11°時(shí)有很微弱的峰，此處為HA與GO重疊的衍射峰.

圖4 不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的XRD圖譜Fig. 4 XRD patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

2. 5 四種HA-GO的FTIR分析

圖5為不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO₃-GO水熱后生成的HA-GO的傅里葉紅外圖譜．由圖5可見(jiàn)，在569和605 cm^-1處為PO₄^3-基團(tuán)的彎曲振動(dòng)峰， 1 050 cm^-1處的吸收峰為PO₄^3-基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰^[23]．同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，712 cm^-1處的球霰石的CO₃^2-基團(tuán)振動(dòng)峰已消失，745 cm^-1處方解石的特征吸收峰也不再出現(xiàn)．1 462 cm^-1和415 cm^-1處為GO的C—O振動(dòng)峰，也為CO₃^2-基團(tuán)的C—O振動(dòng)峰，可能是由于水熱反應(yīng)后仍有部分CO₃^2-存在于HA中．3 500 cm^-1處的吸收峰應(yīng)該是GO的—OH峰．結(jié)合上述XRD分析，碳酸鈣已基本轉(zhuǎn)化為HA，說(shuō)明該水熱反應(yīng)條件下陰離子交換比較徹底.

圖5 不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的傅里葉紅外圖譜Fig. 5 FTIR patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

2. 6 四種HA-GO的FESEM分析

圖6為不同反應(yīng)濃度下制備的HA-GO的SEM圖．在圖6（a）中，0. 1CaCO₃-GO經(jīng)過(guò)水熱反應(yīng)后得到0. 1HA-GO粉末，雖然其基本形態(tài)還呈棒狀，不過(guò)已轉(zhuǎn)化為HA顆粒，呈散亂分布；圖6（b）為0. 3HA-GO，從形貌上看基本成球狀，從部分破碎的微球可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)部呈中空結(jié)構(gòu)，微球表面十分粗糙，大小比較均一；圖6（c）為0. 5HA-GO，可以看到部分微球綴連在GO的邊緣；從圖6（d）的高倍電鏡下可以看到，微球表面有明顯的顆粒存在，這是轉(zhuǎn)化后的納米HA生成在表面；而圖6（e）中的1. 0HA-GO已經(jīng)團(tuán)聚成塊狀了．

2. 7 不同水熱時(shí)間制備的HA-GO的XRD分析

圖7是在180℃進(jìn)行CaCO₃-GO水熱反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為3、6和12 h生成的HA-GO的XRD圖譜．由圖7可見(jiàn)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3h時(shí)，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)卡片已經(jīng)出現(xiàn)HA的晶相，而球霰石的特征衍射峰仍然存在，說(shuō)明兩者共同存在，此時(shí)CaCO₃已經(jīng)開始轉(zhuǎn)化為HA．經(jīng)過(guò)高溫高壓，PO₄^3-開始跟CaCO₃中的CO₃^2-進(jìn)行交換^[24]，但仍有CaCO₃的衍射峰，說(shuō)明部分CaCO₃沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功．而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，交換越來(lái)越徹底，在反應(yīng)6 h和12 h時(shí)，已經(jīng)沒(méi)有CaCO₃的衍射峰，說(shuō)明CaCO₃已完全轉(zhuǎn)化為HA.

圖6 （a）0. 1HA-GO、（b）0. 3HA-GO、（c）0. 5HA-GO、（d）16 000倍鏡下的0. 3HA-GO和（e）22 500倍鏡下的1. 0 HA-GO的SEM圖Fig. 6 SEM images of (a) 0. 1HA-GO, (b) 0. 3HA-GO, (c) 0. 5HA-GO, (d) high magnification of 0. 3HA-GO, and (e) 1. 0 HA-GO.

圖7 不同水熱時(shí)間制備的HA-GO的XRD圖譜Fig. 7 XRD patterns of HA-GO prepared at different hydrothermal times.

2. 8 不同水熱時(shí)間制備的HA-GO的FESEM表征

圖8為不同水熱反應(yīng)時(shí)間（3、6和12 h）條件下制備的HA-GO的SEM圖像．由圖8可以看出，樣品基本都呈球狀，并保持模板CaCO₃的形態(tài)．水熱反應(yīng)時(shí)間3h的樣品，微球表面粗糙，且有微小的顆粒存在．反應(yīng)時(shí)間為6h時(shí)，微球更加粗糙，表面顆粒變大．增加水熱時(shí)間至12 h，有的微球破碎，表面粗糙，內(nèi)部呈現(xiàn)中空結(jié)構(gòu)，有網(wǎng)絡(luò)狀微結(jié)構(gòu)存在．結(jié)合XRD分析，可以看出水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)能獲得形貌較好、轉(zhuǎn)化徹底的HA-GO微球．

圖8 水熱時(shí)間分別為（a）3 h、（b）6 h和（c）12 h制備的HA-GO的SEM圖Fig. 8 SEM images of HA-GO prepared with hydrothermal time of (a) 3 h, (b) 6 h, and (c) 12 h.

因此，以下實(shí)驗(yàn)將使用0. 3HA-GO且水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h、形貌較好的復(fù)合微球進(jìn)行相關(guān)測(cè)試分析.

2. 9 HA-GO的拉曼分析

圖9為HA-GO復(fù)合微球的拉曼光譜．從圖9可見(jiàn)，在1 350 cm^-1處，GO和0. 3HA-GO都有1個(gè)明顯的振動(dòng)峰，稱為D帶，這是石墨烯的無(wú)序振動(dòng)峰．位于1 600 cm^-1的峰屬于石墨烯的本征拉曼模式，稱為G帶．589和960 cm^-1分別對(duì)應(yīng)于v3 （PO₄^3-）反對(duì)稱變角振動(dòng)峰及v1（PO₄^3-）對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，是HA的特征峰．用D帶與G帶的強(qiáng)度比（I_D/ I_G）表征石墨烯材料的無(wú)序度．GO的I_D/ I_G=0. 85，HA-GO的I_D/I_G=0. 94，復(fù)合樣品擁有較高的I_D/I_G，表明復(fù)合樣品中GO的缺陷密度增加.

2. 10 HA-GO的N₂吸附脫附分析

圖 10是0. 3HA-GO微球的Barrett-Joyner-Halenda （BJH）孔徑分布圖以及吸脫附等溫曲線．根據(jù)吸脫附等溫曲線可知，微球的吸脫附等溫曲線符合典型的Ⅲ型等溫線，其滯后環(huán)為H3型^[25]，說(shuō)明微球的組成微粒之間存在許多狹縫型的孔隙，觀察相應(yīng)SEM圖也可相互印證這點(diǎn)．測(cè)得比表面積為22. 71 m²/g．根據(jù)孔徑大小分類：孔徑≤2 nm為微孔；孔徑介于2～50 nm的為介孔；孔徑≥50 nm為大孔．通過(guò)BJH法分析微球孔徑可知，微球的平均孔徑為30～50 nm，屬于介孔材料．結(jié)合以上分析可知，制備的HA-GO復(fù)合微球是內(nèi)部中空結(jié)構(gòu)的介孔材料．

圖9 GO和0.3HA-GO復(fù)合微球的拉曼光譜Fig. 9 Raman spectra of GO and 0. 3HA-GO composite microspheres.

圖 10 HA-GO微球的BJH孔徑分布圖及吸脫附等溫曲線（a）BJH孔徑分布；（b）吸脫附等溫曲線Fig.10 Adsorption-desorption isotherm curve of HA-GO microspheres. (a) BJH pore size distribution map, (b) adsorption and desorption isotherms.

2. 11 細(xì)胞毒性測(cè)試分析

通過(guò)體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞評(píng)估HA-GO復(fù)合微球?qū)?xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖 11．CCK-8的結(jié)果表明，以對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)量為參考標(biāo)準(zhǔn)，不同濃度的浸提液對(duì)細(xì)胞增殖基本沒(méi)有負(fù)面影響，說(shuō)明含復(fù)合微球物質(zhì)的培養(yǎng)液沒(méi)有毒性，因而復(fù)合微球?qū)?xì)胞增殖基本上沒(méi)有毒性．

圖 11 不同體積分?jǐn)?shù)的微球浸提液培養(yǎng)下的細(xì)胞相對(duì)增殖率Fig. 11 Relative proliferation rates in culture extracts of different amounts of the microspheres.

2. 12 姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定得到姜黃素在無(wú)水乙醇中的最佳吸收波長(zhǎng)為（427 ± 1）nm．同時(shí)，在（427 ± 1）nm波長(zhǎng)處測(cè)定配置的一系列姜黃素乙醇溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 12．通過(guò)線性擬合，發(fā)現(xiàn)在姜黃素乙醇溶液質(zhì)量濃度為0. 05～2. 0 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系.

圖 12 姜黃素在無(wú)水乙醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 12 Standard curve of curcumin in absolute ethanol. Black square is the experimental data，and red line is the fitting curve.

2. 13 HA-GO的載藥性能及藥物釋放曲線

包封率和載藥量是衡量載藥微球載藥性能的重要指標(biāo)，載藥量和包封率高可使微球材料得到充分利用，從而減少原材料的浪費(fèi)和給藥次數(shù)，減輕患者頻繁給藥的痛苦，臨床應(yīng)用價(jià)值更高．圖 13為復(fù)合微球的包封率及載藥量，由圖 13可見(jiàn)， 0. 3HA-GO的樣品擁有較好的負(fù)載能力，其載藥量達(dá)到（2. 95 ± 0. 19）% ，包封率達(dá)到（20. 90 ± 0. 31）%．這主要是因?yàn)?. 3HA-GO形成的是表面粗糙內(nèi)部中空的微球，給藥物提供了更多的著位點(diǎn)，利于藥物吸附．

圖 13 HA-GO的包封率與載藥量的柱狀圖Fig. 13 Histograms of drug encapsulation efficiency (black) and drug loading (red) of HA-GO.

由于姜黃素屬于醇溶性物質(zhì)，因此使用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液（pH=1. 5）作為模擬人工胃液進(jìn)行體外釋藥測(cè)試（圖 14）．由圖 14可以看出，載藥復(fù)合微球初釋放時(shí)呈平穩(wěn)釋放，沒(méi)有明顯的突釋現(xiàn)象，在給藥后120 h時(shí)的累計(jì)釋放率達(dá)到72%．由曲線的走勢(shì)來(lái)看，釋放率還在緩慢抬升，說(shuō)明藥物后期還會(huì)釋放，最終藥物累積釋放率將高于72%，說(shuō)明HA-GO微球既能起到緩釋，又能基本將藥物完全釋放.

$圖 14 載藥微球在體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇的模擬人工胃液（pH=1. 4）中的累積釋放率隨時(shí)間變化Fig. 14 Cumulative release rate of drug-loaded microspheres in artificial gastric juice (pH=1. 4) supplemented with volume fraction of 20% ethanol changes with time.$

圖 14 載藥微球在體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇的模擬人工胃液（pH=1. 4）中的累積釋放率隨時(shí)間變化Fig. 14 Cumulative release rate of drug-loaded microspheres in artificial gastric juice (pH=1. 4) supplemented with volume fraction of 20% ethanol changes with time.

結(jié) 語(yǔ)

綜上研究可知，初始底物的反應(yīng)濃度很大程度上影響CaCO₃-GO復(fù)合粉末的微觀形貌，是CaCO₃能否形成球狀結(jié)構(gòu)的重要影響因素．而在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，水熱時(shí)間是轉(zhuǎn)化進(jìn)程是否完成的重要因素， CaCO₃-GO復(fù)合粉末的基本微觀形貌決定了轉(zhuǎn)化后的HA-GO復(fù)合粉末的形貌．研究結(jié)果表明，球狀碳酸鈣作為硬模板，通過(guò)水熱法以離子交換方式能成功制備球狀中空的HA-GO復(fù)合微球．球形CaCO₃-GO的最優(yōu)反應(yīng)條件為0. 3 mol/L的反應(yīng)濃度．制備球形HA-GO的最優(yōu)合成條件為：使用0. 3 mol/L的CaCl₂溶液和0. 3 mol/L的Na₂CO₃溶液制備的CaCO₃-GO復(fù)合產(chǎn)物，在180℃的高壓反應(yīng)釜中水熱反應(yīng)6 h．制備得到的CaCO₃-GO復(fù)合微球的粒徑為5. 1～7. 7 μm，孔徑為30～50 nm．制備的HA-GO復(fù)合微球，以姜黃素作為藥物模型進(jìn)行載藥性能及釋放性能的測(cè)試．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，球狀結(jié)構(gòu)的微球的確能提高藥物的負(fù)載量，復(fù)合微球的包封率能達(dá)到（20. 90 ± 0. 31）% 、載藥量達(dá)到（2. 95 ± 0. 19）%，對(duì)姜黃素起到了緩釋作用，并且釋放較為徹底．研究結(jié)果表明，HA-GO載藥復(fù)合微球展現(xiàn)出良好的醫(yī)用前景．

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